RNA ist ein Schlüsselmolekül für alle lebenden Organismus. Eine wichtige Aufgabe der RNA in der Zelle ist die Regulation der Genexpression. Eine der Strategien, die von der RNA zur Kontrolle und Anpassung der Genexpression an die Umgebung der Zelle verfolgt wird, ist durch Riboswitche, die die Genexpression als Antwort auf die Gegenwart eines bestimmten Moleküls aktivieren oder hemmen können. Riboswitche bestehen aus zwei Teilen, eine sensorische Domäne, in der die Bindung des Zielmoleküls erfolgt, genannt auch Aptamerdomäne und der Expressionsplattform, die die Genexpression beeinflusst. Basierend auf diesem Prinzip konnten Wissenschaftler künstlich synthetische Riboswitch mit in vitro selektierten Aptameren unter Verwendung einer Technik namens SELEX entwickeln. Bislang wurden mehrere synthetische Riboswitches entwickelt, aber es sind immer noch einige wenige im Vergleich zu natürlichen Riboswitches. Eine der Ursachen ist nicht das Fehlen von Aptameren, die ein Zielmolekül erkennen, sondern dass die meisten dieser Aptamere nicht für den Aufbau von Riboswitchen geeignet sind. Tatsächlich ist die Mehrzahl der in vitro selektierten Aptamere nicht in der Lage, die Genexpression zu regulieren. Hierzu ist es nötig, dass die Aptamere bei Ligandenbindung eine Konformationsänderung erfahren. In der klassischen SELEX wird jedoch nur auf Bindung und nicht auf Konformationsänderung selektiert. Vor kurzem wurde eine neue SELEX-Methode entwickelt, Capture-SELEX genannt, die die Auswahl von strukturschaltenden Aptameren gegen kleine Moleküle in Lösung ermöglicht, allerdings für ssDNA und nicht für RNA. Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltete die Entwicklung und Anpassung der Capture-SELEX für RNA. Eine vollständige Anpassung des Protokolls war erforderlich, um diese SELEX nun mit RNA durchzuführen. Weiterhin wurden einige Optimierungsschritte durchgeführt, um die Effizienz zu erhöhen, die zu der ersten erfolgreichen Anreicherung von Aptameren führte, die Neomycin erkennen. Verbesserungen wurden hauptsächlich mit dem Ziel vorgenommen, eine bessere Elution spezifischer Binder zu erreichen, aber auch den Anteil unspezifischer Sequenzen während der Selektion zu verringern. Hierzu wurde ein Hitzeelutionsschritt eingeführt, um schwache Binder zu entfernen, die Zeit der spezifischen Elution verkürzt, um nur Aptamere mit einem schnellen kon auszuwählen und das Design der Bibliothek optimiert. Dank dieser Modifikation konnte die Selektion gegen verschiedene Arten von Molekülen erfolgreich durchgeführt werden und ihre Charakterisierung zeigte die Entwicklung von Aptameren mit hoher Affinität und Spezifität. Da das Hauptziel dieses Projekts die Entwicklung synthetischer Riboswitches war, wurde die mit Paromomycin angereicherte SELEX-Bibliothek zum Screening nach in vivo aktiven Sequenzen verwendet. Nach dem Screening von ca. 1200 verschiedenen Kandidaten wurden mehrere Treffer gefunden und ein Kandidat für das weitere Engineering ausgewählt. Von diesem Kandidaten wurde die Sekundärstruktur durch inline Probing analysiert und eine Ligandenbindung durch ITC-Messung von KD=21 nM bestimmt. Eine hohe Spezifität gegenüber dem Target konnte sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. Mit diesem Kandidaten konnte nicht nur die Expression von GFP, sondern auch von mCherry regulieren werden. Der Kandidat wurde anschließend für die partielle Randomisierung verwendet, um nach verbesserten Mutanten zu suchen. Durch die Kombination mehrerer dieser Mutationen konnte ein Paromomomycin-spezifischer Riboswitch mit einer 8,5-fachen regulatorischen Aktivität entwickelt werden. Basierend auf der Strukturanalyse wurde ein Teil des Riboswitches mit dem Neomycin-Riboswitch für die Erstellung einer Boolschen NOR Gatters kombiniert, was zu einer 30-fachen Regulation führte.