RNA-Editing in afrikanischen Trypanosomen ist eine essenzielle RNA-Prozessierungsreaktion. Sie wird benötigt, um mitochondriale Primärtranskripte, die sonst nicht translatierbar wären, zu entschlüsseln. Die RNA-Editing-Reaktion ist durch das Einfügen und/oder Entfernen von, in einigen Fällen hunderten, Uridylatresten gekennzeichnet. Sie ist auf eine spezifische Klasse von kleinen, nicht-kodierenden RNA-Molekülen angewiesen, die guide (g)RNAs. Die gRNAs stellen die Vorlage für diesen Prozess dar. Sie bilden Basenpaare mit den hochstrukturierten mitochondrialen prä- und partiell edierten mRNAs, bevor ein Multiproteinkomplex, das 20S Editosom, die einzelnen Schritte des RNA-Editing-Zyklus katalysiert. Das 20S Editosom führt eine chaperonartige RNA-Strukturumformung durch. Diese Aktivität wirkt auf prä-edierte Transkripte, wobei die strukturelle Dynamik, primär von U-Nukleotiden, erhöht wird, um die Struktur dieser Substrat-RNAs "aufzulockern".

In Kapitel II präsentiere ich ein in vitro Testsystem, um die Konsequenzen der RNA-Chaperonaktivität auf die Bildung des prä-mRNA-gRNA-Hybrids zu untersuchen. In diesem Testsystem verwende ich kurze, gRNA nachahmende, DNA-Oligonukleotide (gDNA) und weise die Bildung von gDNA/prä-mRNA-Hybriden durch den Verdau mittels Ribonuklease H (RNaseH) nach. Die Daten zeigen, dass die RNA-Chaperonaktivität die Bildung von gDNA/prä-mRNA-Hybriden stimuliert. Damit ermöglicht die RNA-Chaperonaktivität die darauffolgende RNA-Editing-Reaktion.

Die molekulare Ursache der Editosom-inhärenten RNA-Chaperonaktivität ist unbekannt. In Kapitel III über-prüfe ich die Hypothese, dass die Proteine des Editosoms, die ein Oligonukleotid/Oligosaccharid Bindemotif (OB-fold) besitzen, verantwortlich für diese Aktivität sind. Vorhersagen deuten darauf hin, dass diese Proteine in großen Teilen intrinsisch unstrukturiert sind. Weiterhin belegen Experimente, dass diese Proteine eine strukturell wichtige Subdomäne innerhalb des Editosoms bilden. Um die RNA-Chaperonaktivität der Proteine zu untersuchen, habe ich sie als rekombinante Polypeptide hergestellt, sowohl als Konstrukt in voller Länge, als auch als Konstrukt welches nur aus dem OB-fold besteht. Ich bestätigte die Vorhersage der unstrukturierten Proteinbereiche mittels Circulardichroismus-Spektroskopie und analysierte das Homo- und Hetero-Oligomerisierungsverhalten durch Größenausschluss-Chromatographie. Alle OB-fold-Proteinkonstrukte zeigen eine RNA-Chaperonaktivität mit halbmaximalen Aktivitäten im nM Konzentrationsbereich. Die gemessene Aktivität korreliert direkt mit der Oberfläche der unterschiedlichen Proteinkomplexe, was darauf hindeutet, dass der Prozess hauptsächlich durch die Proteinoberflächen bedingt ist. Die Analyse der induzierten RNA-Strukturänderungen wurde mit Nukleotidauflösung mittels Selective 2’-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension (SHAPE) durchgeführt. Die Experimente zeigen, dass der Effekt der homooligomeren OB-fold Proteinkomplexe qualitativ und quantitativ dem Effekt von 20S Editosomen entspricht. Des Weiteren deuten die Daten darauf hin, dass intrinsisch unstrukturierte Proteinregionen involviert sind. Ein grobgranulares Strukturmodell des 20S Editosoms wird präsentiert, das die präferenzielle Anordnung dieser Bereiche an der Oberfläche des Komplexes und die Anordnung von strukturierten Bereichen im Kern des Komplexes unterstützt.

Eine Analyse, die mögliche RNA-Substrat- und Nukleotidpräferenzen der OB-fold vermittelten RNA-Chaperon-aktivität betrachtet, wird in Kapitel IV gezeigt. Dafür wurden Experimente mit dem RNaseH-basierten gDNA Anlagerungstestsystem durchgeführt, die den OB-fold des editosomalen Proteins TbMP24 und 20S Editosomen vergleichen. Zwei unterschiedliche mitochondriale Transkripte wurden in dieser Analyse verwendet: die prä-mRNA, die für das ribosomale Protein S12 (RPS12) kodiert und die prä-mRNA für Apocytochrom B (CYb). Ich analysierte das RPS12 Transkript an zehn verschiedenen Positionen, die unterschiedliche Sequenz- und Strukturmerkmale aufweisen. Die Experimente zeigen, dass sowohl TbMP24-OB als auch 20S Editosomen die Zugäng¬lichkeit der prä-mRNA für die Anlagerung der gDNA an jeder Position der RNA erhöhen. Die TbMP24-OB-Aktivität zeigt keine Präferenz für bestimmte Strukturmerkmale, jedoch eine Präferenz für U-reiche Regionen. Die U-Präferenz wurde mittels SHAPE-Experimenten, der RPS12-RNA mit TbMP24-OB, bestätigt. Sowohl TbMP24-OB als auch 20S Editosomen zeigen eine Aktivität auf beiden Transkripten, mit einer leicht erhöhten Aktivität auf der größeren CYb-RNA. Somit hat TbMP24-OB die gleichen Substratpräferenzen wie das 20S Editosom. Damit kann es als Modellprotein verwendet werden, um die RNA-Chaperonaktivität des 20S Editosoms zu untersuchen.

RNA-Editing ist während des Lebenszyklus von Trypanosoma. brucei differenziell reguliert, jedoch ist die Ursache dafür unbekannt. Der intrazelluläre Ort an dem RNA-Editing stattfindet, das Mitochondrion, unterscheidet sich während der unterschiedlichen Stadien des Lebenszyklus, was zu zwei verschiedenen Redox-Umgebungen führt. In Kapitel V untersuche ich, ob die OB-fold Proteine des Editosoms, als "Redox-Schalter" dienen können. Ich zeige, dass einige der OB-fold Proteine des Editosoms sensitiv gegenüber einer Veränderung der Redox-Umgebung sind, was zu einer veränderten thermischen Stabilität und zu einem veränderten Oligomerisierungsverhalten führt. Um die Effekte der Oxidation auf die Protein¬oligomerisierung zu untersuchen, mutierte ich die Cystein-Codons des TbMP24-OB-kodierenden Gens. Der Austausch aller Cysteine durch Alanine, führt zu einem mutierten Protein, das ein verändertes Oligomerisierungsverhalten aufweist. Die Mutationen führen dazu, dass die Proteinvariante ihren Oligomerisierungszustand nicht mehr ändert und als Dimer, vergleichbar mit dem Wildtypprotein in seiner reduzierten Form, bestehen bleibt. Die Interaktion mit dem Bindepartner TbMP18 ist durch die Cysteinmutationen nicht beeinträchtigt, jedoch ist das Verhältnis der beiden interagierenden Proteine im Komplex verändert. Diese Erkenntnisse sind von Bedeutung für die Assemblierung des Editing-Komplexes in vivo, was darauf hindeutet, dass Redox-Schalter in die Regulation des RNA-Editings, in Abhängigkeit vom Lebenszyklus, involviert sein können.