Pennekamp, Henning (2015)
Alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication
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Item Type: | Ph.D. Thesis | ||||
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Type of entry: | Primary publication | ||||
Title: | Alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen | ||||
Language: | German | ||||
Referees: | Warzecha, Prof. Dr. Heribert ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard | ||||
Date: | 2015 | ||||
Place of Publication: | Darmstadt | ||||
Date of oral examination: | 10 December 2015 | ||||
Abstract: | Malaria ist eine parasitäre Infektionskrankheit, die durch Plasmodien hervorgerufen und von weiblichen Stechmücken der Gattung Anopheles auf den Menschen übertragen wird. Die Krankheit betrifft vor allem Einwohner tropischer und subtropischer Regionen und führte im Jahr 2013 weltweit zu ungefähr 584000 Todesopfern. Aufkommende Insektizidresistenzen der Anopheles-Mücken, Wirkstoffresistenzen der Plasmodien und das Fehlen effizienter Impfstoffe erschweren maßgeblich die globale Malariakontrolle. Da die konventionellen Methoden keinen nachhaltigen Erfolg bei der Verringerung der Malariaübertragung erzielen, wurden in dieser Arbeit die Grundlagen für zwei alternative Strategien gegen Malaria mit Hilfe transgener Pflanzen untersucht. Neben einer Blutmahlzeit zur Eierproduktion benötigen weibliche Anopheles-Mücken zum Überleben natürliche Zuckerquellen, welche primär aus floralem Pflanzennektar bestehen. Durch die Applikation von genetisch verändertem Nektar, der Wirkstoffe gegen die Entwicklung der Plasmodien innerhalb der Mücken enthält, könnte die Übertragung der Erreger auf Menschen verhindert werden. Dazu wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Produktion von doppelsträngiger RNA durch Tabakpflanzen eine Induzierung von RNA-Interferenz in den Speicheldrüsen der Mücken ermöglicht. Somit könnte die Expression von Genen, die für die Plasmodien zur Speicheldrüseninvasion essentiell sind, herunterreguliert werden. Hierfür wurden zunächst transgene Pflanzen generiert, die sequenzspezifische hairpin-RNAs (hpRNA) zur posttranskriptionellen Inhibierung der Expression des apyrase-Gens produzierten. Eine Applikation von Gesamt-RNA-Extrakten an weibliche Anopheles Mücken zeigte nach einer Analyse mittels quantitativer Real-time-PCR jedoch keine Reduzierung der Genexpression. Ein möglicher Grund dafür könnte die geringe Konzentration der in Pflanzen produzierten hpRNAs sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher untersucht, ob die orale Applikation von Nanobodies mit einer Affinität zu Faktor H zur Inhibierung der Plasmodienentwicklung im Mitteldarm der Mücken führen könnte. Die Malariaerreger müssen Faktor H binden, um einer Lyse durch den alternativen Weg des menschlichen Komplementsystems zu entgehen, welches nach der Blutmahlzeit immer noch im Verdauungstrakt des Insektes aktiv ist. Dazu wurden zunächst zwei Phagenbibliotheken mit Hilfe einer zur Verfügung gestellten cDNA-Bibliothek generiert, die aus Blutlymphozyten eines mit Faktor H immunisierten Alpaka/Lama-Hybrids hergestellt worden war. Mit Hilfe eines Phagen-Displays wurden sechs unterschiedliche Nanobodies identifiziert, die gegen Faktor H binden. Nach der Produktion der Nanobodies durch ein bakterielles Expressionssystem, erfolgte deren Charakterisierung mittels ELISA bezüglich ihrer Bindungseigenschaften zu Faktor H. Auf Grund der festgestellten Affinitäten wurde als nächstes mittels einer Analyse durch Bio-Layer-Interferometrie der KD-Wert eines hochaffinen Nanobodies von 1.04×10^9 M festgestellt. Anschließend wurden alle variable domains of camelid heavy chain antibodies (VHHs) mit Hilfe von in vivo Fütterungsversuchen bezüglich ihrer inhibitorischen Wirkung auf den Lebenszyklus der Plasmodien untersucht. Dabei zeigte keiner der verwendeten Nanobodies einen signifikanten inhibitorischen Effekt. Die Gründe dafür könnten sein, dass möglicherweise keiner der Nanobodies an das für die Inhibition essentielle Epitop des Faktor Hs bindet oder dass aufgrund ihrer geringen Größe ein sterischer Effekt zur Blockierung der Bindung an die Malariaerreger ausbleibt. Daher wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus dem Nanobody und einem humanen IgG1-Fc-Teil, mit Hilfe eines viralen Expressionssystems in Tabakpflanzen produziert. Anschließend wurde die Affinität des rekombinanten Proteins zu Faktor H mittels ELISA erfolgreich nachgewiesen. Als nächstes müsste das produzierte Fusionsprotein bezüglich seiner Wirkung auf die Entwicklung der Plasmodien mittels eines in vivo Fütterungsexperiments untersucht werden, um anschließend die Produktion in pflanzlichem Nektar durchzuführen. Damit könnte die orale Applikation von VHH-Fc-Fusionsproteinen durch genetisch veränderten Nektar an Anopheles Mücken eine alternative Strategie zur Reduktion der Malariaübertragung auf den Menschen darstellen. |
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Alternative Abstract: |
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Uncontrolled Keywords: | Malaria, Anopheles, Plasmodium, Nanobody, RNA-Interferenz, transgene Pflanzen | ||||
URN: | urn:nbn:de:tuda-tuprints-52051 | ||||
Classification DDC: | 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology | ||||
Divisions: | 10 Department of Biology 10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering |
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Date Deposited: | 17 Dec 2015 10:57 | ||||
Last Modified: | 17 Dec 2015 10:57 | ||||
URI: | https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5205 | ||||
PPN: | 386814333 | ||||
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