Cytochrom-P450-Enzyme als vielseitige Biokatalysatoren stellen bedeutende Werkzeuge für ein gezieltes Metabolic Engineering dar. Damit eröffnen sich vielfältige neue Möglichkeiten für einen gezielten Eingriff in den pflanzlichen Sekundärstoffwechsel, vor allem in Hinblick auf die Erzeugung neuer pharmakologisch aktiver Substanzen in Medizinalpflanzen. Die Beobachtung, dass rekombinante E. coli Kulturen bei Expression des humanen CYP2A6 in der Lage waren, endogenes Indol zu hydroxylieren und zur Bildung von Indigo beizutragen, warf die Frage auf, ob ein Eingriff in den Sekundärmetabolismus von Tabakpflanzen ebenfalls zur Bildung von Indigo führen kann. Vorarbeiten zeigten, dass die Expression von CYP2A6 im Kerngenom nicht zur Bildung von Indigo, sondern lediglich zu einer geringen Synthese des Glycosids Indican führte. Da die Expressionslevel eher gering und auch nicht stabil waren, sollte in dieser Arbeit evaluiert werden, ob die Integration des Transgens CYP2A6 in das Chloroplastengenom zu einer gesteigerten Expression und auch zu einer höheren Akkumulationsrate der Metabolite führt. Ebenfalls sollte untersucht werden, ob aufgrund des Fehlens von Glykosyltransferasen in den Chloroplasten die direkte Bildung von Indigo möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression des humanen CYP2A6 im Chloroplastengenom unter Verwendung der Vektoren pNT2 und pRB95 und des Promotors psbA grundsätzlich möglich ist. Es stellte sich heraus, dass die Expressionslevel der transplastomen Pflanzen sehr gering waren und mit zunehmenden Pflanzenalter weiter abnahmen, sodass nach etwa sechs Wochen kein CYP2A6 Protein mehr detektiert werden konnte. Die Gründe hierfür sind auf eine generell schwache RNA-Synthese als auch auf die Instabilität der mRNA zurückzuführen. Fütterungsexperimente zeigten jedoch, dass das gebildete humane Cytochrom in der Lage ist, bereitgestelltes Indol zu hydroxylieren. Da keine zusätzliche Expression einer NADPH-Reduktase erfolgte, werden die für die Aktivität des Cytochroms benötigten Reduktionsäquivalente durch noch nicht bekannte andere Mechanismen bereitgestellt. Die Optimierung des Expressionssystems durch Verwendung einer Kodon-optimierten CYP2A6-Sequenz sowie durch Verwendung eines konstitutiven Promotors führte zwar zu größeren Mengen an stabiler RNA, jedoch zu keiner gesteigerten Proteinsynthese. Im Gegenteil, es konnte zu keiner Zeit Protein detektiert werden, was wahrscheinlich auf eine falsche Faltung des Proteins und einen daraus resultierenden frühzeitigen Proteinabbau zurückzuführen ist. Trotzdem konnte auch hier die Bildung geringer Mengen Indican nachgewiesen werden. Abschließend kann gesagt werden, dass auch die Expression vonCYP2A6 im Chloroplastengenom nicht zur Änderung des Phänotyps der Pflanze durch Bildung von Indigo führt und in diesem Fall die geringe Expression als auch die Glykosylierung von Indoxyl limitierende Faktoren für das gezielte Metabolic Engineering darstellen.

Da über Chloroplasten-lokalisierte NADPH-Reduktasen bisher nichts bekannt ist, wurde die NADPH-Reduktase ATR2 aus Arabidopsis thaliana näher charakterisiert. Dabei waren zwei Sequenzmerkmale von besonderem Interesse. Das ist zum einen die N-terminale Signalsequenz, die eine Lokalisation des Proteins in den Chloroplasten vorhersagen lässt, zum anderen das Vorkommen einer Lipobox, die als typisches bakterielles Lipidierungssignal bekannt ist. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass bei Expression des Reduktase-Gens in Bakterien der N-Terminus erkannt wird und dies zur Lipidierung des Proteins führt. Ebenso führt eine Mutation des essenziellen Cystein innerhalb der Lipobox nicht zur Lipidierung des Proteins. Weiter konnte dargelegt werden, dass die Signalsequenz bei Expression in Pflanzen nicht als Lipidierungssignal erkannt wird und somit keine Lipidierung erfolgt, unabhängig von der Mutation als auch unabhängig vom Fehlen des N-Terminus. Abschließend kann außerdem die wichtigste Aussage getroffen werden, dass ATR2 anders als bisher vermutet, nicht im Chloroplasten lokalisiert ist.