In den vergangenen Jahrzehnten haben sich monoklonale Antikörper als leistungsstarke Biologika erwiesen, die die Behandlung verschiedener Krankheiten, darunter Krebs, revolutioniert haben. Dennoch werden weiterhin Forschungsanstrengungen unternommen, um die Funktionalität von Antikörpern zu steigern und damit die Generierung präziserer und wirksamerer Antikörpertherapeutika zu ermöglichen. Die erste Studie im Rahmen dieser kumulativen Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung eines konditional aktivierten anti-IgM Antikörper-Wirkstoff-Konjugats zur präzisen Bekämpfung von B-Zell-Lymphomen. Zu diesem Zweck wurde ein vom Huhn stammender IgM-spezifischer Antikörper (aIgM) isoliert und mit der epitoptragenden IgM-Domäne CH2 als affinitätsbasierte Maskierungseinheit über einen tumorproteaseempfindlichen Linker fusioniert. Der entwickelte CH2-maskierte aIgM Antikörper zeigte keine Wechselwirkungen mit IgM aus Humanserum, während die Proteasebehandlung des CH2-aIgM die Antigenbindungsfunktionalität wiederherstellte. Auf zellulärer Ebene war CH2-aIgM auch inert gegenüber Wechselwirkungen mit IgM-positiven Lymphom-B-Zellen, wohingegen die Protease-gespaltene Variante ausgezeichnete Zellbindungsaffinitäten im einstelligen nanomolaren Bereich aufwies, vergleichbar mit dem unmaskierten parentalen Antikörper. Die aIgM Antikörpervarianten wurden anschließend mit dem zytotoxischen Wirkstoff Monomethylauristatin E (MMAE) zur Generierung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten gekoppelt. Die spezifische und effektive rezeptorvermittelte zelluläre Aufnahme des aIgM Antikörpers stand in engem Zusammenhang mit der Induktion des apoptotischen Lymphomzelltodes. Demzufolge war die Zytotoxizität des inaktiven CH2-aIgM Antikörper-Wirkstoff-Konjugats auf ein Minimum reduziert. Da Off-Target-Effekte die therapeutische Wirksamkeit von Antikörpern beschränken, gewährleistet das Design des maskierten aIgM Antikörper-Wirkstoff-Konjugats die Diffusion im systemischen Blutkreislauf, ohne von sekretierten, pentameren IgM Molekülen abgefangen zu werden oder nicht-maligne IgM-positive B-Zellen zu beeinträchtigen. Bei Erreichen des Tumors führt die Protease-vermittelte Linker-Hydrolyse zur Antikörper-Wirkstoff-Konjugat-Aktivierung und zum anschließenden Tod der Krebszelle, wodurch der therapeutische Index, der durch die Toxizität des Medikaments im Verhältnis zu seiner Wirksamkeit bestimmt wird, erweitert wird. Das Ziel des zweiten Projekts bestand in der Entwicklung von T-Zell-Rezeptor-direktionierten Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten zur Behandlung von Krebserkrankungen, die von T-Zellen ausgehen. Da es nicht möglich ist, Pan-T-Zell-Antigene zu adressieren, weil dieses mit dem Risiko einer lebensbedrohlichen T-Zell-Aplasie verbunden ist, wurde ein tumorspezifischer Antikörper entworfen, der auf den klonspezifischen T-Zell-Rezeptor (T cell receptor, TCR) einer malignen T-Zellpopulation abzielt. Nach der Isolierung eines anti-TCR (aTCR) Idiotyp Antikörpers aus einer Huhn-Immunbibliothek erfolgte die Konjugation mit dem zytotoxischen Mikrotubuli-Inhibitor MMAE über einer spaltbaren Linker, was zur Generierung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten mit einem durchschnittlichen Verhältnis von Wirkstoff zu Antikörper von zwei beziehungsweise fünf führte. Der unkonjugierte Antikörper wies eine ausgezeichnete Spezifität und Affinität im einstelligen nanomolaren Bereich zu dem Target-TCR auf molekularer und zellulärer Ebene auf. Die aTCR Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, deren Wirkung in erster Linie auf der Induktion des apoptotischen Zelltods beruht, zeigten in vitro eine starke anti-Tumor-Aktivität. Nach der zellulären Freisetzung des Zytotoxins wurden proliferations-hemmende Bystander-Effekte auf Nicht-Tumor-Zellen beobachtet, die möglicherweise zusätzlich zu den tumoriziden Eigenschaften der aTCR Antikörper-Wirkstoff-Konjugate beitragen. Dieser neuartige, maßgeschneiderte Ansatz ermöglicht eine effiziente Eliminierung von Lymphom-/Leukämie-T-Zellen, während das für eine intakte zelluläre Immunität verantwortliche T-Zell-Repertoire erhalten bleibt. Der dritte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Entwicklung bispezifischer Killerzell-Engager (BiKE) die Spezies-kreuzreaktive NKG2D-Binder nutzen, um menschliche und murine Lymphozyten auf ErbB2/HER2-positive Erkrankungen auszurichten. Die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) über den aktivierenden Rezeptor der natürlichen Killergruppe 2, Mitglied D (NKG2D) stellt eine neue Strategie für die Krebstherapie dar, die sich die zytotoxische Immuneffektorfunktion von NK-Zellen zunutze macht. Die Generierung kreuzreaktiver Antikörper für Mensch- und Maus-NKG2D wurde durch eine Reihe aufeinanderfolgender Immunisierungen eines Huhns mit den Rezeptoren beider Spezies und anschließender Durchmusterung der Antikörperbibliothek erreicht. Nachfolgend wurden bispezifische tetravalente Antikörper aus einer Reihe von vier isolierten anti-NKG2D single-chain variable fragments (scFvs) in Kombination mit einer zuvor beschriebenen anti-ErbB2/HER2-targetierenden Einheit hergestellt. Die vier entwickelten BiKE-Moleküle (bezeichnet als scNKAB-ErbB2) zeigten Bindungsspezifität und -affinität gegenüber HER2/ErbB2-exprimierenden Krebszellen sowie NK-92-Zellen, die mit von humanem und murinem NKG2D abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren modifiziert wurden, und NKG2D-positiven primären humanen und murinen Lymphozyten. Die Konkurrenz zwischen scNKAB-ErbB2 und dem natürlichen NKG2D-Liganden MICA wurde untersucht, wobei sich herausstellte, dass zwei der Entitäten mit MICA konkurrieren und dadurch Immun-Escape-Mechanismen von Tumoren verhindern können. Schließlich erwiesen sich alle vier BiKEs als effektiv in der spezifischen Redirektionierung der zytotoxischen Aktivität von menschlichen und murinen NKG2D-CAR-modifizierten NK-92-Zellen und primären menschlichen und murinen Lymphozyten auf ErbB2-positive Krebszellen. Diese neu entwickelten BiKEs haben das Potential, die NKG2D-abhängige NK-Zell-Zytotoxizität auf Tumorzellen zu vermitteln und mit der implementierten Immunrezeptor-Spezies-Kreuzreaktivität die präklinische Entwicklung in immunkompetenten Maus-Tumormodellen zu erleichtern. Zusammengefasst zielen die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Projekte darauf ab, funktional erweiterte Antikörper für eine präzise Krebstherapie zu entwickeln. Der Einsatz neuartiger, fortschrittlicher Modifikationen in Antikörpern, wie beispielsweise konditional freigesetzte Maskierungseinheiten, hochwirksame zytotoxische Wirkstoffe, maßgeschneiderte Spezifitäten sowie zusätzliche Spezifitäten, die Immun-Effektorzellen effektiv rekrutieren, könnte den Grundstein für eine neue Generation von Antikörper-basierten Krebstherapien legen.