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Development of a soil granule based on the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum to control Agriotes spp.

Seib, Tanja Sarah Vanessa Michele (2024)
Development of a soil granule based on the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum to control Agriotes spp.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00028147
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Development of a soil granule based on the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum to control Agriotes spp.
Language: English
Referees: Jehle, Prof. Dr. Johannes ; Jürgens, Prof. Dr. Andreas
Date: 10 October 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 187 Seiten
Date of oral examination: 17 September 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00028147
Abstract:

Crop protection faces particularly great challenges for the food production of a growing world population and in view of climate change. However, agriculture always has to contend with crop losses caused by plant pests and diseases. Pest insects of particular importance are wireworms, the larvae of click beetles, which cause reduced crop quality or crop losses in many cultured plants, such as potatoes, maize, cereals, asparagus or lettuce, by feeding on roots, tubers and seedlings. In Europe, larvae of the genus Agriotes, including the species Agriotes lineatus, Agriotes obscurus and Agriotes sputator, are considered a particularly severe problem. Because of their development in the soil, lasting two to five years, depending on the species and environmental conditions, they are difficult to control. Biological control strategies are advantageous, because, unlike chemical ones, they usually pose a low risk to the environment, applicators and consumers. Especially the effect of entomopathogenic fungi (EPF) against wireworms has been well documented. For these reasons, the aim of this dissertation was to develop a soil granule based on EPF to control larvae of the species A. lineatus, A. obscurus and A. sputator. Four steps were taken to achieve this goal. In the first step, an effective fungal strain against Agriotes larvae was determined. Then, the producibility of the fungal strain in liquid medium was optimized and the ability to formulate it by using a fluid bed dryer was investigated. In the fourth step, the influence of the production temperature on different quality factors of the developed granule as well as on virulence factors of the fungal strain were investigated. To identify an effective fungal strain against the three Agriotes species, the virulence of six Metarhizium spp. and two Cordyceps spp. strains was compared (Chapter I). The Cordyceps strains proved to have no pathogenic effect on the larvae, whereas all Metarhizium strains were able to infect and kill the larvae and led to fungal growth on the cadaver. However, the effect of the individual Metarhizium strains on the three Agriotes species differed. Treatment with the Metarhizium brunneum strain JKI-BI-1450 resulted in the highest mortality against larvae of A. lineatus with 58% and A. obscurus with 94% and intermediate mortality of A. sputator with 56%, compared to the other fungal strains. The highest mortal effect against A. sputator larvae was caused by the Metarhizium robertsii strain JKI-BI-1442 with 94%. In order to explain the different mortality, the speed of germination, the germination after 96 h and the conidial size of the Metarhizium strains were determined. Conidia of the three M. brunneum strains (JKI-BI-1339, JKI-BI-1450 and LRC112) germinated between 96.8-98.5% after 96 h, whereas the conidia of the M. robertsii strains (JKI-BI-1441, JKI-BI-1442 and JKI-BI-1448) only germinated between 90.7-93%. τ, the time point where 50% of the maximal germinated conidia are germinated, was reached significantly faster by JKI-BI-1339 and JKI-BI-1450 after 14.5 h and 15.1 h, respectively. The longest conidia were formed by LRC112 and the widest by JKI-BI-1442. Subsequently, it was investigated whether these factors correlate with final mortality; however, this was not the case. Furthermore, it was investigated whether the effect of the fungal strains varies not only between the different Agriotes species, but also within larvae of one species between various populations obtained from different locations. Therefore, the effect of the two M. brunneum strains JKI-BI-1450 and ART2825 on different larval populations was investigated, as these fungal strains are already proven to be highly effective against Agriotes larvae. The mortality and mycosis effect of the two investigated fungal strains on the larvae of A. obscurus differed between the populations. The final mortality of A. obscurus larvae lay between 44-94% when treated with JKI-BI-1450 and between 30-95.6% when treated with ART2825. There was no difference observed between the populations of A. lineatus larvae and the final mortality was 38% for the JKI-BI-1450 treatments and 48% and 53.5% for the ART2825 treatments. Although the final mortality did not differ significantly between the different populations of A. sputator larvae and lay between 26-36% for JKI-BI-1450 and between 10.7-41.8% for ART2528, there were significant differences found in the time to larval death. Restricted mean time lost (RMTL) differed significantly between the populations and was between 3.6-18.5 for JKI-BI-1450 and between 6-21.5 for ART2825. The M. brunneum strain JKI-BI-1450 turned out to be a promising candidate for wireworm control, but the different efficacy against the Agriotes species and, in the case of A. obscurus, also against different populations, is problematic because so its field efficacy is difficult to predict. The development of a control strategy based on several fungal strains would be a possible solution. In order to determine the producibility of the fungi, in chapter II all six Metarhizium strains were cultivated in three standard liquid media and the formation of submerged spores was evaluated. All fungal strains could be proliferated in liquid cultures and achieved spore concentrations of around 10^7 submerged spores ml^-1 except for LRC112 with a maximum of 6 × 10^4 submerged spores ml^-1. All further experiments were exclusively carried out with JKI-BI-1450 based on its efficacy. The submerged spore and biomass formation of JKI-BI-1450 was studied at different temperatures and after different incubation periods. The highest submerged spore formation was achieved after 48 h at 25 °C with 6.5 × 10^5 submerged spores ml^-1, as was the highest biomass formation also after 48 h, but at 30 °C with 3.2%. Afterwards, the growth of JKI-BI-1450 in a 3-Liter bioreactor at 25 °C was studied. It was found that submerged spore formation had its optimum between 42.5-48 h after inoculation with spore concentrations between 1.43-2 × 10^6 submerged spores ml^-1, whereas the biomass formation increased to 1.43% throughout 72 h duration of fermentation. To increase fungal production in liquid culture, the influence of the concentration of the media components (glucose, corn steep solid, sodium chloride) was evaluated. The increase of glucose and corn steep solid in the medium resulted in a steady rise of biomass production up to 28.0 g l^-1 and 23.0 g l^-1, respectively. In contrast, changing the sodium chloride concentration in the medium produced inconsistent results, although the highest concentration resulted in the greatest biomass formation with 14.7 g l^-1. After production in liquid culture, the fungal broth must be formulated to make it suitable for storage and application. In chapter III, fluid-bed drying was chosen for the formulation of JKI-BI-1450, in which a thin layer of fungal biomass was sprayed on millet and simultaneously dried. This formulation method proved to be well suited for the production of granule, requiring 4.5 mg of fungal biomass per gram of granule to achieve a granule colonization of nearly 100%. To increase or accelerate the fungal growth on the granule, chitin and various sugars were added to the fungal biomass before spraying and drying. The supplementation of chitin showed no positive effect, whereas the addition of the sugars led to an acceleration of colonization as well as of the formation of conidia, with the best results obtained for fructose. The addition of fructose increased granule colonization from 5.6 to 62.2% after one day of incubation and conidia formation from 3.35 × 10^5 to 1.13 × 10^6 conidia per granule grain after 5 days of incubation. The storage stability of the granule was also investigated, as this is important to provide sufficient shelf-life of the final product. After 12 weeks of storage at 5 °C, the granule colonization was still over 90%. The examination of granule quality under simulated field conditions showed that at the optimum residual soil moisture contents of 30% and 45%, the highest colonization was found at 25 °C and 30 °C with 98.9-100% and the most conidia per granule grain at 25 °C with 3.0-3.5 × 10^6. Furthermore, it was demonstrated that the reduction of colonization and formation of conidia was lower when only one environmental parameter (temperature and humidity) was unfavourable compared to both factors being disadvantageous. In addition, a fungicidal seed treatment (Moncut®) was identified as compatible with the developed granule without significant loss of granule colonization. In chapter IV, it was investigated how the production temperature of the fungus affects granule colonization and conidia formation on the granule, as well as on germination, conidial size and virulence of the conidia. For this purpose, the biomass required for granule preparation was produced at different temperatures and the produced granules were also incubated at different temperatures. The fungus on the granules demonstrated the highest colonization with 87.17% and conidia formation with 2.77 × 10^7 conidia per granule grain when the biomass was produced at 25 °C. Furthermore, conidia were produced at different temperatures and then also incubated at different temperatures. Afterwards, their size, germination and virulence were investigated. The conidia produced at 20 °C were significantly wider with 2.21 µm compared to those produced at 25 °C and 30 °C with 2.19 µm. Furthermore, conidia produced at 15 °C reached τ significantly later (15.42 h) than conidia produced at 30 °C (12.31 h). The production temperature of the conidia had no effect on the virulence against Galleria mellonella larvae. The mortality ranged between 95.63-100% for all production temperatures with a survival time of 50% (ST50) between 3.97-4.54 days. With regard to the incubation temperature, it was found that at 30 °C smaller conidia were formed with 6.54 µm, germination was faster with τ of 11.40 h and the fungal treatment led to a faster mortality with a ST50 of 3.16 days. In summary, this dissertation identified M. brunneum JKI-BI-1450 as pathogenic against larvae of all three Agriotes species examined. This fungal strain can be produced in liquid medium and formulated into granule by fluid-bed drying. Both, production and formulation were improved by adjusting the process parameters or media composition and supplementing additives. Furthermore, it was shown that the quality of a fungus-based soil granule can already be influenced by the production conditions of the biomass used for it.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Pflanzenschutz steht für die Nahrungsproduktion einer wachsenden Weltbevölkerung und angesichts des Klimawandels vor besonders großen Herausforderungen. Allerdings hat die Landwirtschaft seit jeher mit Ernteausfällen zu kämpfen, welche von Schädlingen und Pflanzenkrankheiten verursacht werden. Ein besonders wichtiges Schadinsekt ist der Drahtwurm, die Larven der Schnellkäfer, der durch seinen Fraß an Wurzeln, Knollen und Sämlingen bei vielen Kulturpflanzen wie Kartoffeln, Mais, Getreide, Spargel oder Salat zu Qualitätseinbußen oder Ernteausfällen führt. In Europa gelten die Larven der Gattung Agriotes, einschließlich der Arten Agriotes lineatus, Agriotes obscurus und Agriotes sputator, als besonders großes Problem. Aufgrund ihrer Entwicklung im Boden, die je nach Art und Umweltbedingungen zwei bis fünf Jahre dauert, sind sie schwer zu bekämpfen. Eine Biologische Bekämpfung ist von Vorteil, da sie im Gegensatz zur Anwendung chemischer Pflanzenschutzmittel in der Regel geringe oder keine Risiken für die Umwelt, die Anwender und die Verbraucher darstellen. Insbesondere die Wirkung entomopathogener Pilze gegen Drahtwürmer ist vielfach dokumentiert. Aus diesen Gründen war das Ziel der vorliegenden Dissertation die Entwicklung eines biologischen Bodengranulats auf Basis eines entomopathogenen Pilzes zur Bekämpfung von Larven der Arten A. lineatus, A. obscurus und A. sputator. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden vier Schritte unternommen. Im ersten Schritt wurde ein gegen Agriotes-Larven wirksamer Pilzstamm ermittelt. Anschließend wurde die Produzierbarkeit des Pilzstammes in flüssigem Medium optimiert und die Möglichkeit der Formulierung mittels Wirbelschichttrocknung untersucht. Im vierten Schritt wurde der Einfluss der Produktionstemperatur auf verschiedene Qualitätsfaktoren des entwickelten Granulats sowie auf Virulenzfaktoren des Pilzstammes untersucht. In Chapter I wurde die Virulenz von sechs Metarhizium- und zwei Cordyceps-Stämmen verglichen, um einen wirksamen Pilzstamm gegen die drei genannten Agriotes-Arten zu identifizieren. Die Cordyceps-Stämme zeigten keine pathogene Wirkung auf die Larven, während alle Metarhizium-Stämme in der Lage waren, die Larven zu infizieren, zu töten, und zu Pilzwachstum auf den Kadavern zu führen. Die Wirkung der Pilzstämme auf die Larven der drei Agriotes-Arten war jedoch unterschiedlich. Die Behandlung mit Metarhizium brunneum JKI-BI-1450 führte im Vergleich zu den anderen Pilzstämmen zur höchsten Mortalität der Larven von A. lineatus mit 58 % und A. obscurus mit 94 % und zu einer mittleren Mortalität bei A. sputator mit 56 %. Die beste Wirkung gegen A. sputator-Larven hatte der Metarhizium robertsii-Stamm JKI-BI-1442 mit 94 %. Um eine Erklärung für die unterschiedlichen Wirkungen zu erhalten, wurden die Keimungsgeschwindigkeit, die Keimung nach 96 h und die Konidiengröße der Metarhizium-Stämme bestimmt. Die Konidien der drei M. brunneum-Stämme (JKI-BI-1339, JKI-BI-1450 und LRC112) keimten nach 96 h zu 96,8-98,5 %, die Konidien der M. robertsii-Stämme (JKI-BI-1441, JKI-BI-1442 und JKI-BI-1448) hingegen nur zu 90,7-93 %. τ, der Zeitpunkt, an dem 50 % der maximal gekeimten Konidien gekeimt sind, wurde von JKI-BI-1339 und JKI-BI-1450 nach 14,5 h bzw. 15,1 h signifikant schneller erreicht. Die längsten Konidien wurden von LRC112 gebildet und die breitesten von JKI-BI-1442. Daraufhin wurde untersucht ob diese Parameter mit der finalen Mortalität korrelieren, was jedoch nicht der Fall war. Weiterhin wurde untersucht, ob die Wirkung der Pilzstämme nicht nur zwischen den verschiedenen Agriotes-Arten, sondern auch innerhalb einer Art zwischen verschiedenen Populationen von unterschiedlichen Standorten variiert. Daher wurde die Wirkung der beiden Stämme M. brunneum JKI-BI-1450 und ART2825 auf verschiedene Larvenpopulationen untersucht, da diese Pilzstämme nachweislich eine gute Wirkung gegen Agriotes-Larven haben. Die Wirkung der beiden Pilzstämme auf die Larven von A. obscurus unterschied sich zwischen den Populationen. Die finale Mortalität der A. obscurus-Larven lag bei der Behandlung mit JKI-BI-1450 zwischen 44-94 % und bei der Behandlung mit ART2825 zwischen 30-95,6 %. Zwischen den Populationen der A. lineatus Larven gab es keine Unterschiede, wobei die finale Mortalität bei den Behandlungen mit JKI-BI-1450 bei 38 % und bei den Behandlungen mit ART2825 bei 48 % und 53,5 % lag. Obwohl sich die finale Mortalität zwischen den verschiedenen Populationen der A. sputator-Larven nicht signifikant unterschied und zwischen 26-36 % für JKI-BI-1450 und zwischen 10,7-41,8 % für ART2528 lag, gab es signifikante Unterschiede bei der Zeit bis zum Tod der Larven. Die Restricted Mean Time Lost (RMTL) unterschied sich signifikant zwischen den Populationen und lag zwischen 3,6-18,5 für JKI-BI-1450 und zwischen 6-21,5 für ART2825. Der Pilzstamm M. brunneum JKI-BI-1450 erwies sich als vielversprechender Kandidat für die Drahtwurmbekämpfung, aber die unterschiedliche Wirksamkeit gegen die Agriotes-Arten und im Fall von A. obscurus auch gegen verschiedene Populationen ist problematisch, da seine Wirksamkeit im Feld dadurch schwer vorherzusagen ist. Die Entwicklung einer Kontrollstrategie, die auf mehreren Pilzstämmen basiert, wäre eine mögliche Lösung. Um die Produzierbarkeit der Pilze zu bestimmen, wurden in Chapter II alle sechs Metarhizium Stämme in drei flüssigen Standardmedien kultiviert und die Bildung von Submerssporen bestimmt. Alle Pilzstämme ließen sich in Flüssigkulturen produzieren und erreichten eine Sporenkonzentration von ca. 10^7 Submerssporen ml^-1 außer LRC112 mit einer maximalen Sporenkonzentration von 6 × 10^4 Submerssporen ml^-1. Alle weiteren Versuche wurden aufgrund der Wirksamkeit ausschließlich mit JKI-BI-1450 durchgeführt. Die Bildung von Submerssporen und Biomasse dieses Pilzstammes wurde bei verschiedenen Temperaturen und nach unterschiedlichen Inkubationszeiten untersucht. Die maximale Bildung von Submerssporen wurde nach 48 h bei 25 °C mit 6,5 × 10^5 Submerssporen ml^-1 erreicht, die maximale Biomassebildung ebenfalls nach 48 h, aber bei 30 °C mit 3,2 %. Anschließend wurde das Wachstum von JKI-BI-1450 in einem 3-Liter-Bioreaktor bei 25 °C untersucht. Es wurde ermittelt, dass die Bildung von Submerssporen ihr Optimum zwischen 42,5-48 h nach der Inokulation mit Sporenkonzentrationen zwischen 1,43-2 × 10^6 Submerssporen ml^-1 hatte, wohingegen die Biomassebildung während der gesamten 72-stündigen Fermentationsdauer auf 1,43 % anstieg. Um die Pilzproduktion in Flüssigkultur zu steigern, wurde der Einfluss der Konzentration der Medienkomponenten (Glukose, Corn steep solid, Natriumchlorid) untersucht. Die Erhöhung der Glukose sowie des Corn steep solid im Medium führten zu einer stetigen Zunahme der Biomasse auf 28,0 g l^-1 bzw. 23,0 g l^-1. Im Gegensatz dazu führte die Änderung des Natriumchlorid-Gehaltes im Medium zu uneinheitlichen Ergebnissen, wobei auch hier die höchste Konzentration zur größten Biomassebildung mit 14,7 g l^-1 führte. Nach der Produktion in Flüssigkultur ist es notwendig, die Biomasse zu formulieren, um ein ausbring- und lagerfähiges Produkt zu erhalten. In Chapter III wurde die Wirbelschichttrocknung zur Formulierung von JKI-BI-1450 gewählt, bei der eine dünne Schicht Pilzbiomasse auf Hirse gesprüht und gleichzeitig getrocknet wurde. Diese Formulierungsmethode erwies sich als gut geeignet für die Herstellung eines Granulates, wobei 4,5 mg Pilzbiomasse pro Gramm Granulat benötigt wurden, um eine Granulatkolonisierung von nahezu 100 % zu erreichen. Um das Pilzwachstum auf dem Granulat zu steigern bzw. zu beschleunigen, wurden der Pilzbiomasse vor dem Sprühen und Trocknen Chitin und verschiedene Zucker zugesetzt. Die Zugabe von Chitin zeigte keine positive Wirkung, während die Zugabe der Zucker zu einer Beschleunigung der Kolonisierung sowie der Konidienbildung führte, wobei die besten Ergebnisse mit Fruktose erzielt wurden. Die Zugabe von Fruktose erhöhte die Granulatkolonisierung von 5,6 % auf 62,2 % nach einem Tag Inkubation und die Konidienbildung von 3,35 × 10^5 auf 1,13 × 10^6 Konidien pro Granulatkorn nach 5 Tagen Inkubation. Auch die Lagerstabilität des Granulats wurde untersucht, da dies wichtig ist, um eine ausreichende Haltbarkeit des Endprodukts zu gewährleisten. Nach 12 Wochen Lagerung bei 5 °C lag die Kolonisierung des Granulats immer noch bei über 90 %. Die Untersuchung der Granulatqualität unter simulierten Feldbedingungen zeigte, dass bei den optimalen Bodenrestfeuchten von 30 % und 45 % die höchste Kolonisierung mit 98,9-100 % bei 25 °C und 30 °C erreicht wurde und die meisten Konidien pro Granulatkorn mit 3,0-3,5 × 10^6 bei 25 °C gebildet wurden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die durch einen ungünstigen Umweltparameter (Temperatur und Feuchtigkeit) verursachte Verringerung der Kolonisierung und Konidienbildung geringer war, wenn der andere Umweltparameter im optimalen Bereich lag. Außerdem wurde ein fungizides Saatgutbehandlungsmittel (Moncut®) als kompatibel mit dem entwickelten Granulat identifiziert, ohne dass es zu einer signifikanten Verringerung der Granulatkolonisierung kam. In Chapter IV wurde untersucht, wie sich die Produktionstemperatur des Pilzstammes auf die Granulatkolonisierung und die Konidienbildung auf dem Granulat sowie die Keimung, Konidiengröße und Virulenz der Konidien auswirkt. Zu diesem Zweck wurde die für die Granulatherstellung benötigte Biomasse bei unterschiedlichen Temperaturen erzeugt und die daraus hergestellten Granulate ebenfalls bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Der Pilz auf dem Granulat zeigte die höchste Kolonisierung mit 87,17 % und Konidienbildung mit 2,77 × 10^7 Konidien pro Granulatkorn, wenn die Biomasse bei 25 °C hergestellt wurde. Darüber hinaus wurden Konidien bei verschiedenen Temperaturen produziert und dann ebenfalls bei verschiedenen Temperaturen inkubiert und deren Größe, Keimung und Virulenz untersucht. Die bei 20 °C produzierten Konidien waren mit 2,21 µm signifikant breiter als die bei 25 °C und 30 °C produzierten mit 2,19 µm. Außerdem erreichten die bei 15 °C produzierten Konidien τ signifikant später (15,42 h) als die bei 30 °C produzierten Konidien (12,31 h). Die Produktionstemperatur der Konidien hatte keinen Einfluss auf die Virulenz gegenüber Galleria mellonella-Larven. Die Mortalität lag bei allen Produktionstemperaturen zwischen 95,63- 100 % mit einer Überlebenszeit von 50 % (ST50) zwischen 3,97-4,54 Tagen. In Bezug auf die Inkubationstemperatur wurde festgestellt, dass bei 30 °C kürzere Konidien mit 6,54 µm gebildet wurden, die Keimung schneller erfolgte mit τ von 11,40 h und die Pilzbehandlung zu einer schneller eintretenden Mortalität mit einer ST50 von 3,16 Tagen führte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Dissertation M. brunneum JKI-BI-1450 als Pathogen für die Larven aller drei untersuchten Agriotes-Arten identifiziert wurde. Dieser Pilzstamm kann in Flüssigmedium produziert und mittels Wirbelschichttrocknung zu einem Granulat formuliert werden. Sowohl die Produktion als auch die Formulierung konnten durch die Anpassung der Prozessparameter oder der Medienzusammensetzung sowie durch die Zugabe von Zusatzstoffen verbessert werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Qualität eines Bodengranulats auf Pilzbasis bereits durch die Produktionsbedingungen der dafür verwendeten Biomasse beeinflusst werden kann.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-281478
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Microbial Control / Insect Virology and Molecular Insect Pathology
Date Deposited: 10 Oct 2024 12:34
Last Modified: 17 Oct 2024 06:00
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/28147
PPN: 522219101
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