Den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildet die Charakterisierung der Bindestellen (Epitope) von Antikörpern bzw. Aptameren der vier Modellproteine Interleukin-8 (IL8, CXCL8), Cathepsin D (CTSD), α-Glucosidase A (GAA) und Survival Motor Neuron Protein (SMN). Allen Teilprojekte gemeinsam war die Isolierung von potenziellen Epitoppeptiden aus einem enzymatischen Verdau des jeweiligen Proteins durch die Affinitätschromatographie an immobilisiertem Antikörper bzw. Aptamer. Dieser Versuchsaufbau wird Epitopextraktion genannt.¹ Die einzelnen Fraktionen von der Affinitätssäule wurden mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisierungs-Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-tof MS)² untersucht, um anhand der Peptidmassen die Epitoppeptide und deren Sequenz zu bestimmen. Zur weiteren Validierung der identifizierten Peptide wurde deren Affinität zu den Antikörpern mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Biosensoranalyse untersucht.³ Dabei sollte auch die Epitopextraktion mit Sepharose gebundenem Antikörper mit einer Variante verglichen werden, bei der der Antikörper direkt auf einem SPR-Chip immobilisiert war.⁴ Die Epitopcharakteriserung ist beim Verständnis der Funktion von Antikörpern und bei der Entwicklung verschiedenster Bioassays von Bedeutung. Die Modellproteine stehen alle in Verbindung mit verschiedenen Krankheiten, sei es als Zielproteine bei der Behandlung von Krankheiten oder als potenzielle Biomarker. Dabei wird IL8⁵ mit chronisch entzündlichen Krankheiten, wie rheumatoider Arthritis (RA), SMN⁶ mit der Muskelatrophie (SMA), und CTSD⁷ und GAA⁸ mit verschiedenen lysosomalen Speicherkrankheiten in Verbindung gebracht. Die Aufklärung Epitope von Antikörpern an diese Proteine können dabei helfen, deren biologische Funktionen besser zu verstehen. Zum Beispiel inhibiert der Antikörper gegen IL8 dessen Rezeptorbindung und entsprechende Funktionen, kann aber auch zu dessen Nachweis eingesetzt werden. Epitoppeptide können aber auch zur Quantifizierung eines Proteins verwendet werde, das als Biomarker für eine bestimmte Krankheit dient, wie beim SMN-Protein, das ein Biomarker für die spinale Muskelatrophie ist. Bei CTSD wiederum sollten die Bindungsstellen eines Antikörpers mit denen eines Aptamers verglichen werden und die Epitoppeptide von GAA sollten bei der Enzymersatztherapie (ERT) mittels Apherese dabei helfen, Antikörper gegen das Medikament aus dem Blut zu entfernen. Bei den Epitopextraktionsexperimenten für den Komplex von IL8 mit dem monokonalen Antikörper mAB-I2519 konnten Epitoppeptide besonders gut identifiziert werden, wenn die entsprechenden Antikörper über Protein G an Goldchips gebunden waren. Die Untersuchung von IL8 und seinen Peptiden wurde durch deren relativ starke Bindung an die verschiedensten Oberflächen, wie an die Sepharose 4B, erschwert. Beim Einsatz von Peptiden aus einem tryptischen Verdau ergab sich ein diskontinuierliches Epitop für mAB-I2519, das aus IL8[12-20] und IL8[55-60] besteht. Die Affinitäten der Antikörper-Antigen Komplexe wurden mit dem SPR-basierten Biosensor bestimmt. Die Immobilisierung wurde ebenfalls über Protein G erreicht und ergab stabile und hochaktive Antikörperoberflächen. Für die Wechselwirkung von IL8 mit mAB-I2519 wurde eine KD von 7,4 nM ermittelt, für das Peptid IL8[12-20] eine KD von 75,1 μM und für IL8[55-60] von 0,98 mM. Beide Peptide binden den Antikörper im Paratop mit geringer Affinität, weswegen beide in einer bestimmten Konformation präsentiert werden müssen, um den Antikörper mit einer entsprechend hohen Affinität zu binden. IL8[12-20] ist Teil der Rezeptorbindungsstelle und IL8[55-60] ist für die Bindung an Glykane auf Zelloberflächen verantwortlich, was wichtig für die IL8-Gradientenbildung zur Rekrutierung von Leukozyten ist. Daher hemmt mAB-I2519 gleichzeitig die Bindung von IL8 an seinen Rezeptor und an Zelloberflächen und verhindert auf diese Weise dessen biologische Wirkung. Mit den gleichen Methoden, wie zur Analyse der Interaktion von IL8 mit mAB-I2519, wurden das SMN-Protein und sein monoklonaler Antikörper mAB-7B10 untersucht. Für den Komplex von SMN und mAB-7B10 wurde ein bekanntes Epitop auf den SMN-Protein in Form des tryptischen Peptids rSMN[37-57] extrahiert. Die Epitopextraktion konnte in diesem Zusammenhang auch erfolgreich von einem SPR-Biosensorchip durchgeführt werden. Die Affinität von mAB-7B10 zu rSMN beträgt 0,25 - 0,69 nM; für das synthetische Epitoppeptid rSMN[37-57] liegt sie bei 3,2 nM. Aufgrund der gut erhaltenen Affinität des Epitoppeptids wurde es erfolgreich in einem Konzeptbeweis für einen diagnostischen Assay eingesetzt, mit dem das SMN-Protein aus biologischen Proben durch Epitopextraktion und MALDI-tof MS quantifiziert werden kann. Geeignete Kalibrierungskurven in Verbindung mit einer ersten erfolgreichen Extraktion des Epitoppeptids aus einer Vollblut-Lysatprobe wurden erhalten. Zusätzlich wurden polyklonale Antikörper mit einem Epitop im C-terminalen Bereich von SMN zusammen mit mAB-7B10 in einen Sandwich-SPR-Assay getestet, der als alternative Strategie zur Quantifizierung des SMN-Proteins eingesetzt werden könnte. Die Signalverstärkung durch den zweiten Antikörper soll dabei zu einem noch sensitiveren Assay führen. Die Untersuchung der CTSD-Antikörper bzw. -Aptamer-Komplexe und des GAA-Antikörper-Komplexes führten zu keiner eindeutigen Identifizierung von Epitoppeptiden und Bindungsstellen. Dies war vor allem auf die große Menge an unspezifischen Sepharose-bindenden Peptiden, die aus dem jeweiligen Proteinverdau mit Trypsin und Chymotrypsin stammten, zurückzuführen. Zur erfolgreichen Epitopidentifizierung müssten daher alternative Methoden verwendet werden. Um in Zukunft Proteinepitope, die über die Epitopextraktion schwerzugänglich sind, frühzeitig zu erkennen, müssen spezifische Scouting-Experimente für unspezifische säulenbindende Peptide aus Proteinverdauen mit unterschiedlichen Proteasen durchgeführt werden. Dadruch könnte der Schwierigkeitsgrad eines zu bestimmenden Epitopes mit der Epitopextraktionsmethode eingeschätzt werden. Für den GAA-Antikörper war bekannt, dass das Epitope im 70 kDa Fragement des Proteinkomplexes liegen soll, weswegen hier das Epitop zumindest auf eine Region um GAA[317-324], GAA[304-349], und GAA[411-458] eingegrenzt werden konnte. Zusätzlich zu den experimentellen Laborarbeiten wurden in-silico Prädiktoren für die B-Zell-Epitop Vorhersage eingesetzt, um die identifizierten Peptide als Teil eines potenziellen Epitops zu bewerten. Die verwendeten Softwaretools, DiscoTope 2.0,⁹ Seppa 3.0,¹⁰ BepiPred 2.0¹¹ und BCEPS¹² und deren Vorhersagen über die Epitope, beinhalteten die identifizierten Epitope aus den Analysen mit SMN und IL8. Für CTSD und GAA wurden viele der identifizierten Peptide ebenfalls als potenzielle Epitope vorhergesagt, aber wegen des großen Anteils von unspezifischen Bindern konnten keine eindeutigen Epitoppeptide ausgemacht werden. Für die untersuchten Proteine zeigten die Epitopvorhersagen jedoch, dass andere Proteasen, wie Glu-C, Lys-C oder Arg-C, für die Bildung von epitopabbildenden Peptiden von Vorteil gewesen wären, die die potenziellen Epitope nicht an potenziell kritischen Positionen für die Antikörperbindung gespalten hätten. Daher kann die in silico Analyse zur Planung und Verbesserung des Versuchsaufbaus für eine bestimmte Epitopidentifizierung beitragen. Schließlich wurde der enzymatische Verdau von Proteinen unter hohem Druck mit den vier Modellproteinen getestet, da dieser Schritt essenziell für die Epitopextrkation ist. Der Hochdruckverdau wurde unter wiederholten Zyklen von hohem und niedrigem Druck durchgeführt und wird als „pressure cycling technology“ bezeichnet.¹³ Die Tests wurden mit Trypsin durchgeführt und die erhaltenen Peptide wurden mittels MS charakterisiert. Unter anderem wurden Parameter für die Sequenzabdeckung, Verdauungsgeschwindigkeit, Enzymspezifität und erhaltene Peptidpeakmuster mit einem Standardverfahren unter Atmosphärendruck verglichen. Die Parameter zeigten ähnliche Werte für den Verdau unter atmosphärischem und hohem Druck. Es gibt Anzeichen dafür, dass für den Hochdruckaufschluss wesentlich geringere Mengen des Enzyms verwendet werden könnten, wobei einige Stunden oder weniger für den vollständigen Verdau ausreichen. Dies muss weiter untersucht werden. Außerdem bestätigen diese Experimente, dass Trypsin seine Spezifität und Aktivität unter hohem Druck nicht verändert.