Proteine sind Biomoleküle mit einer inhärenten Flexibilität, die es ihnen ermöglicht, ihre Funktionen durch Interaktion mit anderen Proteinen, Substraten, Zellen und vielen anderen Molekülen zu erfüllen. Die strukturelle Flexibilität eines Proteins kann die Liganden-Protein-Bindung beeinflussen, und bei einigen therapeutischen Zielmolekülen kann dies den Zugang der Liganden zu ihrer Bindungsstelle einschränken. Dies stellt ein Hindernis für die Entwicklung neuer Moleküle zur Hemmung oder Aktivierung eines Zielproteins dar. Das FK506-bindende Protein 51 (FKBP51) gehört zur Immunophilin-Familie und wird mit verschiedenen psychiatrischen und stressbedingten Störungen sowie mit vielen anderen Krankheiten in Verbindung gebracht. Verschiedene Proteine der FKBP-Familie verfügen über eine FK1-Domäne mit einer hochkonservierten aktiven Stelle (oder orthosterischen Stelle). Dies ist nicht spezifisch für FKBPs, sondern es kommt recht häufig vor, dass man weitgehend konservierte orthosterische Stellen innerhalb einer Proteinfamilie findet. Aufgrund kleiner Unterschiede in der Aminosäuresequenz von FKBP51 weist dieses Protein eine höhere Flexibilität als andere FKBPs auf, was sich in einer größeren Anzahl möglicher Konformere niederschlägt. Eines dieser bekannten Konformere bildet eine transiente Bindungstasche, die möglicherweise selektive Liganden von FKBP51 aufnehmen kann, ohne mit anderen Mitgliedern dieser Proteinfamilie zu interagieren. Der Schwerpunkt dieser Doktorarbeit liegt in der Entwicklung von Forschungsinstrumenten, um das Konformationsensemble von FKBP51 vom nativen Niedrigenergiezustand (geschlossene Konformation) in ein Konformer mit einer stabilisierten transienten Bindungstasche zu überführen, die konformationsspezifische Liganden binden kann. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit einer Protein-Engineering- und Screening-Strategie, die zur erfolgreichen Identifizierung von FKBP51-Varianten mit einer bevorzugt offenen Konformation der transienten Bindungstasche. Zu diesem Zweck wurden die Aminosäuren der FKBP51 FK1-Domäne systematisch durch Zufalls- und Sättigungsmutagenese (SSM) verändert, um FKBP51-Muteine zu finden, die das koformationelle Gleichgewicht des Proteins in Richtung einer offenen Konformation ändern, wodurch die Bindung von konformationsspezifischen Liganden begünstigt wird. Zunächst wurde das Gen, das für die FK1-Domäne von FKBP51 kodiert, mittels Random Mutagenese mutiert. Mit diesem genetischen Material wurde eine Yeast Surface Display (YSD)-Bibliothek mit einem Pool von Mutagenese-Varianten erstellt und mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) mit hohem Durchsatz durchmustert. Aus dieser ersten Bibliothek wurde eine spezifische Region im Protein identifiziert, die die FKBP51-Bindungstasche destabilisiert. Anschließend wurde eine SSM der identifizierten Region, die sich von G64 bis S69 erstreckt, angewandt, und eine zweite YSD-Bibliothek erstellt, die ebenfalls mittels FACS gescreent wurde. Aus dieser SSM-Bibliothek wurden Schlüsselreste für die Destabilisierung der FKBP51-Bindungstasche identifiziert. Drei Muteine mit erhöhter Affinität zu konformationsspezifischen Liganden (G64S, F67E und D68Y) wurden charakterisiert und es wurde nachgewiesen, dass sie die Bildung einer kryptischen Stelle erleichtern, die die Bindung von Liganden in offener Konformation ermöglicht. In nachfolgenden Experimenten wurden diese drei verbesserten FKBP51-Varianten als Ausgangspunkt für die Erstellung von Bibliotheken mit weiteren Mutationen verwendet, um die Affinität zu Liganden mit offener Konformation weiter zu optimieren. Additive SSM-Bibliotheken, die auf kombinatorischer und iterativer Mutagenese basieren, ergaben über 20 FKBP51-Varianten mit zwei oder mehr Mutationen, die die Ligandenbindung verbesserten. Darüber hinaus bestätigten Varianten mit einer mutierten Position K121 die Bedeutung dieser Schleifenregion, die in den ersten Experimenten nicht identifiziert werden konnte. In allen vier verschiedenen Bibliotheken wurden über 30 einzigartige FKBP51-Muteine mit einer oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren gefunden. FKBP51 ist eines von vielen Proteinen mit einer kryptischen Bindungstasche. Kryptische Stellen in einem Protein bieten eine einzigartige Gelegenheit, Liganden mit hoher Affinität zu entwickeln, die selektiv an das Zielprotein binden, ohne mit strukturell ähnlichen Proteinen zu interagieren, und folglich Off-Target-Effekte zu vermeiden. Unsere auf Protein-Engineering basierende Forschung nutzte FKBP51 als Modell, um die Möglichkeiten und potenziellen Vorteile von Protein-Engineering-Methoden in Verbindung mit einem Zell-Display-System wie Yeast Surface Display (YSD) und FACS zu testen, um Varianten mit verstärkter Bindung an Liganden mit offener Konformation zu identifizieren. Diese Methoden sind auf andere Proteine übertragbar, die ähnlich wie FKBP51 eine transiente Bindungstasche aufweisen. Mit dieser schrittweisen Methodik kann ein Zielprotein systematisch modifiziert werden, um eine Population von einem nativen Zustand mit einem schwach besiedelten Konformer und einer kryptischen Stelle in eine Population mit einer offenen Konformation zu verschieben, die die Bindung selektiver Liganden ermöglicht. Der zweite Teil dieser Studie konzentrierte sich auf die Verwendung von aus Hühnern gewonnenen einkettigen variablen Fragmenten (scFvs) als konformationsverriegelnde Moleküle, um die offene Konformation von FKBP51 zu stabilisieren und das Screening neuartiger selektiver Hemmstoffe zu erleichtern. Ein allosterischer Effektor, in diesem Fall ein scFv, wäre in der Lage, das Konformationsensemble des Proteins umzuverteilen und dabei eine niedrig besiedelte Konformation im ungebundenen Zustand optimal zu begünstigen. Aufgrund des großen evolutionären Abstands zwischen Menschen und Vögeln haben Hühner eine stärkere Immunreaktion auf menschliche Proteine, als es bei der herkömmlichen Immunisierung von Mäusen zur Entwicklung von Antikörpern der Fall ist. Aus diesem Grund wurde ein Gallus gallus Exemplar mit der FK1-Domäne von FKBP51 immunisiert. Aus der Milz-RNA des immunisierten Tieres wurde ein Pool von scFvs synthetisiert und zur Erstellung einer YSD-Bibliothek verwendet. Diese Bibliothek wurde dann in verschiedenen Kampagnen gescreent, um entweder hochaffine Binder, konformationssperrende oder blockierende scFvs zu erhalten. Während keine blockierenden scFvs gefunden wurden, brachte die Conformation-Locking-Screening-Kampagne sechs verschiedene scFvs hervor, von denen einer (bezeichnet als Kandidat T32) potenzielle allosterische Effekte auf FKBP51 hatte, die die Bindung von kanonischen und konformationsselektiven Liganden beeinflussten. Mehrere Fluoreszenzpolarisations- (FP) und Biolayer-Interferometrie- (BLI) Experimente konnten die Wirkung von T32 als konformationsbindendes scFv nachweisen. Diese Wirkung von T32 wurde nachfolgend orthogonal durch Wasserstoff-/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) untersucht, welche das Bindungsepitop auf FKBP51 und eine deutliche Konformationsänderung im Bereich der Bindungstasche durch allosterische Effekte des T32 scFv aufzeigte. Darüber hinaus wurde das gleiche Ziel verfolgt, indem die Suche nach hochaffinen Bindern und allosterischen Effektoren auf das Screening von Affibody-Molekülen übertragen wurde. Diese kleinen Moleküle sind von der Z-Domäne von Staphylococcus aureus abgeleitet. Ein Affibody besteht aus einer 3-Helix-Struktur, bei der ausgewählte Aminosäuren auf zwei ihrer Helices randomisiert sind, um eine synthetische Bibliothek zu schaffen, die als Antikörper-ähnliches Molekül fungiert und hochaffine Binder für viele Zielproteine liefern kann. Eine Escherichia coli Display-Bibliothek, die Affibodies exprimiert, wurde mit der FK1-Domäne von FKBP51 gescreent. Sechs Screening-Runden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) und FACS ergaben vier Affibody, die FKBP51 binden, und einen davon mit potenzieller Wirkung auf die Ligandenaufnahme. Methoden zur Stabilisierung der transienten Bindungstasche von FKBP51, entweder durch die Verwendung von FKBP51-Muteinen oder durch Wechselwirkungen mit einem scFv, stellen ein unschätzbares Forschungsinstrumentarium zur Charakterisierung der molekularen Dynamik der Bindungstasche dar und bieten eine Alternative zur Suche nach neuen selektiven FKBP51-Liganden im Rahmen eines Fragmentscreenings. Darüber hinaus können sowohl scFvs als auch Affibodies als FKBP51-Binder an jedes beliebige Nachweisreagenz konjugiert werden, was sie zu effektiven Ressourcen für die biochemische Charakterisierung von FKBP51 macht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse haben Biomoleküle hervorgebracht, die bei der Erforschung und Charakterisierung von FKBP51 und bei der Suche nach hochaffinen und selektiven Liganden, die an die kryptische Tasche von FKBP51 binden, eingesetzt werden können.