In den letzten Jahren hat die Immuntherapie die Behandlung bestimmter Blutkrebsarten revolutioniert. Durch die Ausstattung von T-Lymphozyten mit chimären Antigenrezeptoren (CAR), die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, wurden große klinische Erfolge bei der Eliminierung von Tumorzellen erzielt. Die CAR T Zelltherapie stößt jedoch weiterhin auf Hindernisse, die einer breiteren Anwendung und höheren klinischen Wirksamkeit im Wege stehen. Dazu gehören primär der hohe Aufwand bei der Herstellung sowie die Qualität der resultierenden CAR-T-Zellen in Bezug auf Wirksamkeit und in vivo-Persistenz. Die genetische Modifikation von T-Zellen erfolgt in der Regel durch Transduktion mit lentiviralem Vektor (LV). Im Herstellungsprozess gehen der Transduktion umfangreiche Isolierungs- und Aktivierungsschritte voraus, um einen sicheren und effizienten Gentransfer in ausschließlich T-Zellen zu gewährleisten. Die Verwendung von T Zell spezifischen LV könnte diese Schritte umgehen, das Risiko einer unerwünschten Transduktion verringern und die Transduktion nicht-aktivierter T Zellen ermöglichen. Der CD3 Rezeptor targetierte LV (CD3-LV) ist hier von potentieller Bedeutung, da der CD3-Rezeptor im Komplex mit dem T-Zell-Rezeptor (engl. T cell receptor, TCR) ausschließlich auf T-Zellen exprimiert wird und CD3-LV nachweislich nicht-aktivierte T-Zellen aktiviert und transduziert. Die CD3-LV-induzierte T Zellaktivierung führt jedoch zu einer verstärkten Runterregulierung des CD3:TCR Komplexes, was letztlich die Gentransferraten dämpft und somit die klinische Anwendung verhindert. Im Hinblick auf die Qualität des CAR-T-Zellprodukts wird die CAR-T-Zellaktivität häufig durch eine begrenzte Expansion und Persistenz der Zellen im Patienten beeinträchtigt, die durch die Differenzierung und frühe Erschöpfung der CAR-T-Zellen verursacht wird. So haben sich CAR-T-Zellen mit dem T Gedächtnis Stammzell Phänotyp (engl. T stem cell memory, TSCM) gegenüber konventionellen CAR-T-Zellen als überlegen erwiesen, da sie eine starke Proliferation und eine verlängerte Antitumorantwort im Patienten zeigen. Bisherige Versuche die Häufigkeit von CAR TSCM-Zellen zu erhöhen, beschränkten sich auf die Einführung zusätzlicher Schritte im Herstellungsprozess. Um die genannten Hindernisse der CAR T Zelltherapie zu überwinden, wurden in dieser Arbeit die Moleküle Dasatinib und Urolithin A (UA) auf ihre Anwendbarkeit im Zusammenhang mit CAR-T-Zellen und deren Herstellung getestet. Dasatinib ist ein Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), der die Phosphorylierung durch die T-Zell-spezifischen Tyrosinkinase Lck hemmt und somit die Aktivierung der T-Zellen verhindert. Im Gegensatz dazu induziert UA nachweislich Mitophagie, was mit positiven immunmodulatorischen Effekten wie einer verbesserten Antitumorwirkung assoziiert ist.

Die Inkubation von peripheren mononuklearen Blutzellen (engl. peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) mit Dasatinib vor der Transduktion mit CD3-LV(GFP) steigerte die Transduktionseffizienz um das 3- bis 10-fache. Der Effekt war zeit- und konzentrationsabhängig und zeigte eine maximale Verstärkung nach fünfstündiger Inkubation der Zellen mit 50 nM Dasatinib, resultierend in über 60% transduzierter T Zellen. Die transduktionsverstärkende Wirkung von Dasatinib beeinträchtigte weder die Zellviabilität noch die Zellproliferation und wurde durch die Kombination mit dem Transduktionsverstärker Vectofusin-1 (VF 1) noch verstärkt. Dasatinib steigerte zudem die Transduktion von Zytokin stimulierten PBMCs und nicht-aktivierten PBMCs in Vollblut. Im Mausmodell zeigte sich, dass die Behandlung mit Dasatinib die Selektivität von CD3-LV nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus zeigte eine Maus, die vor der Verabreichung von CD3 LV mit Dasatinib behandelt wurde, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen eine leicht erhöhte Transduktionsrate und Integration des Vektorgenoms. Während Dasatinib die Transduktionseffizienz von CD3-LV in den verschiedenen Experimenten erhöhte, hatte es keine Auswirkungen auf die Transduktion mit CD4-, CD8- oder VSV LV. Die Hemmung der Endozytose oder anderer Tyrosinkinasen verstärkte die Transduktion durch CD3-LV nicht. Stattdessen erhöhte die Inhibierung der CD3 LV induzierten T-Zellaktivierung mit Dasatinib die Oberflächenexpression des CD3 Rezeptors und verbesserte die Bindung von CD3-LV an die Zellen. Dies ist höchstwahrscheinlich die Ursache für die transduktionsverstärkende Wirkung von Dasatinib. Die Generierung von CAR-T-Zellen durch Transduktion mit CD3-LV in Gegenwart von Dasatinib führte zu hohen CAR T Zellzahlen, vergleichbar mit denen die mit herkömmlichen LV erzielt werden. Diese CAR-T-Zellen waren in der Lage, Tumorzellen effizient zu eliminieren, während sie weniger Erschöpfungsmarker exprimierten und einen geringfügig naiveren Phänotyp aufwiesen. Während die zytotoxische Aktivität der CAR-T-Zellen gegen die Tumorzellen nicht beeinträchtigt wurde, war die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen bei CAR-T-Zellen, die in Gegenwart von Dasatinib generiert wurden, reduziert. Dies war unabhängig davon, ob die CAR T Zellen mit CD3- oder VSV-LV transduziert wurden. Dasatinib reduzierte also nicht nur die durch CD3-LV-induzierte Stimulation, sondern auch die durch LV Transduktion induzierte Stimulation im Allgemeinen. Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Wirkung von UA auf T-Zellen und die Generierung von CAR-T-Zellen untersucht. Hierfür, wurden T-Zellen kurz nach der Transduktion mit LV in Medium mit 25 µM UA über mehrere Tage kultiviert. Die Kultivierung der Zellen in UA-haltigem Medium führte zu einer 10-fachen Expansion der TSCM-Zellen, was bei CAR-exprimieren den T-Zellen zu 50% TSCM-Zellen führte. Diese Veränderung des Phänotyps ist höchstwahrscheinlich auf die Induktion der Mitophagie zurückzuführen ist. Die Kultivierung der Zellen in UA-haltigem Medium hatte keinen Einfluss auf die Transduktionseffizienz oder CAR Expression. Der hohe Anteil an CAR-TSCM-Zellen beeinflusste weder die zytotoxische Aktivität von CD19.CAR- noch von CEA.CAR-T-Zellen. Anschließend wurde der transduktionsverstärkende Effekt von Dasatinib mit CD3-LV und der Expansion der CEA.CAR TSCM-Zellen durch UA kombiniert. Die Kombination beider Behandlungen ermöglichte die selektive Transduktion von 40% der T-Zellen, von denen 30% den TSCM-Phänotyp aufwiesen, und führte dadurch zur Generierung zytotoxischer CAR TSCM-Zellen.

Diese Arbeit beschreibt erstmals die Funktion von Dasatinib als Transduktionsverstärker für CD3-LV und identifiziert eine neue Klasse von Transduktionsverstärkern. Dasatinib gehört zu einer hier erstmals beschriebenen Klasse von Transduktionsverstärkern, die nicht durch Erleichterung der Vektor Zell Interaktion außerhalb der Zelle wirken, sondern die Verfügbarkeit des Zielrezeptors durch intrazelluläre Mechanismen, in diesem Fall Lck-Inhibition, erhöhen. Auf diese Weise verhindert Dasatinib die Runterregulierung des CD3:TCR Rezeptorkomplexes, erhöht die Bindung von CD3-LV an die Zelle und hilft durch die Fusion von mehr CD3 LV-Partikeln mit der Zelle, mögliche intrinsische Restriktionsfaktoren (RFs) zu umgehen. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit ein einfaches Protokoll für die Expansion von CAR-TSCM-Zellen entwickelt. Die Kultivierung von Zellen in UA-haltigem Medium erhöht die Menge der CAR-TSCM-Zellen signifikant und bietet eine vereinfachte Methode zur Anreicherung von TSCM-Zellen im Vergleich zu bestehenden Methoden. Dies zeigt, dass UA in der Lage ist, menschliche T-Zellen durch Induktion von Mitophagie in Richtung des TSCM-Phänotyps umzuprogrammieren, wodurch die Fitness der T-Zellen verbessert und eine wertvolle Quelle für zukünftige Tumortherapien geschaffen wird.