Domänen sind die strukturellen und funktionalen Untereinheiten von Proteinen. Die Rekombination bestehender Domänen dient als Quelle evolutionärer Innovationen, die neue Proteinfunktionen und -eigenschaften ermöglichen kann. Inspiriert von der Natur nutzt das Protein Engineering häufig die Domänenrekombination, um künstliche Proteine mit maßgeschneiderten Eigenschaften herzustellen. Die Kontrolle über Proteinaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem schaltbare Domänen genutzt und funktionell mit Effektordomänen verknüpft werden. Viele natürliche Proteindomänen zeigen Konformationsänderungen als Reaktion auf exogene Auslöser. Die Insertion licht-schaltbarer Rezeptordomänen in ein beliebiges Effektorprotein ermöglicht beispielsweise die Kontrolle der Effektoraktivität mit Licht. Die resultierenden optogenetischen Proteine sind leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision. Darüber hinaus ermöglichen optogenetische Proteine vielfältige biotechnologische Anwendungen und gelten sogar als potenzielle Kandidaten für zukünftige Therapeutika. In dieser Studie konzentrierten wir uns zunächst auf Geneditierung mittels CRISPR-Cas9 und wendeten eine Domäneninsertionsstrategie auf genetisch codierte Inhibitoren der CRISPR-Cas9-Nuklease aus Neisseria meningitidis (NmeCas9) an. Diese Nuklease ist aufgrund ihrer geringen Größe und hohen DNA-Sequenzspezifität von großem Interesse für Anwendungen der CRISPR-Genomeditierung. Durch die Fusion stabilisierender Domänen mit dem NmeCas9 Inhibitorprotein AcrIIC1 konnten wir dessen suppressive Wirkung verstärken und so einen effektiven Ausschalter für die Geneditierung herstellen. Darüber hinaus ermöglichte die Insertion der lichtempfindlichen LOV2-Domäne von Avena sativa in AcrIIC3, den wirksamsten NmeCas9 Inhibitor, die optogenetische Kontrolle der Geneditierung durch lichtgesteuerte NmeCas9-Hemmung. Weitere Untersuchungen der konstruierten Inhibitoren unterstrichen das Potenzial, das diese Proteine in Bezug auf die Absicherung der CRISPR-Technologie haben könnten, indem sie die Off-Target-Veränderung von DNA selektiv reduzieren. Die mühsame Optimierung der konstruierten CRISPR-Inhibitoren, die zur damaligen Zeit notwendig war, motivierte uns, Potenzial und Limitationen des Protein-Engineerings durch Domäneninsertion unter Verwendung eines randomisierten Insertionsansatzes systematischer zu untersuchen. Früher wurden einzelne Proteindomänen normalerweise nur an wenigen bewusst ausgewählten Stellen in Zielproteine eingeführt. In dieser Studie dagegen, fügten wir bis zu fünf strukturell und funktionell nicht verwandte Domänen an allen möglichen Positionen in verschiedene Kandidatenproteine ein. Die resultierenden Bibliotheken von Proteinhybriden wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und anschließende Next-Generation-Sequenzierung (Flow-seq) auf Aktivität gescreent. Das Trainieren von Machine Learning Modellen auf Grundlage der den resultierenden, umfassenden Datensätzen ermöglichte es uns, Parameter zu analysieren, die sich auf die Insertionstoleranz der Proteine auswirken. Es zeigte sich, dass Parameter der Sequenzkonservierung die besten Prädiktoren für den Erfolg von Domain-Insertionen sind. Schließlich führte die Erweiterung unserer experimentellen Flow-seq-Pipeline für das Screening von engineerten, schaltbaren Effektorvarianten zu zwei potenten optogenetischen Versionen des E. coli-Transkriptionsfaktors AraC. Diese neuartigen Hybride werden die Co-Regulierung der bakteriellen Genexpression durch Licht und Chemikalien ermöglichen. Zusammenfassend zeigt unsere Studie das Design von funktionell unterschiedlichen Proteinschaltern für die Kontrolle der Geneditierung und Genexpression in Säugetierzellen bzw. E. coli. Darüber hinaus ermöglichte die Erstellung eines großen Domäneninsertionsdatensatzes erstmals die unvoreingenommene Untersuchung der Insertionstoleranz in mehreren evolutionär nicht verwandten Proteinen. Unsere Studie zeigt die vielfältigen Chancen und verbleibenden Herausforderungen hinter dem Engineering von Proteinen mit neuen Eigenschaften und Funktionalitäten durch Domänenrekombination.