Obwohl biobasierte Kraftstoffe und Chemikalien eine attraktive und nachhaltigere Alternative zu den traditionellen erdölbasierten Kraftstoffen und Chemikalien darstellen, ist die Herstellung in industriellem Maßstab bis heute schwierig. Historisch gesehen wird E. coli für die Produktion genutzt, und biochemischen Veränderungen von Genen und deren Expression auf Plasmid-Ebene wurden meist auf Intuition basierend auf einer Trial-and-Error-Basis durchgeführt. Dieser Ansatz kann sehr kosten- und arbeitsintensiv sein, und ist für industrielle Anwendungen daher nur mäßig geeignet. Hier stellen wir unsere Arbeit zum Einsatz fortschrittlicher Werkzeuge der synthetischen Biologie und des Gene Editing vor, die das Verständnis und das Engineering der mikrobiellen Stoffwechselwege beschleunigen können, und somit systematisch und robuste Verbesserungen der Produktion von Biokraftstoffen und Bioprodukten ermöglichen.

Das Gesamtziel der Arbeit ist die Untersuchung und Optimierung von E. coli Stoffwechselwegen für die effiziente Produktion von biobasierten Chemikalien. Zwei E. coli-Stoffwechselwege wurden untersucht, und die Titer von zwei Zielverbindungen wurden mit Hilfe von Gene Editing, Stammentwicklung und Werkzeugen der synthetischen Biologie optimiert. Kapitel drei dieser Arbeit umfasst die parallele Integration und chromosomale Erweiterung des Isoprenoid-Stoffwechselwegs in das E. coli-Genom zur Verbesserung des Isopentenol-Titers. In dieser Studie nutzten wir die Integration und unabhängige Expansion von drei Stoffwechselwegkomponenten in mehreren Loci. Suizid-Vektoren wurden verwendet, um eine hocheffiziente ortsspezifische Integration von sequenzvalidierten Multigen-Komponenten zu erreichen, und ein hitzemodifizierbares Plasmid wurde eingeführt, um die recA-Deletion nach der Pathway-Expansion zu vermeiden. Durch 3-dimensionale Expansion generierten wir Bibliotheken von Pathway-Komponenten mit unterschiedlichen Kopienzahlen, um verbesserte Titer zu erreichen. Maschinelles Lernen wurden genutzt, um die Genexpression für die Isopentenol-Titer vorherzusagen. Die statistische Modellierung der Produktions-Screening-Daten mit einem polynomialen Regressor legte nahe, dass eine Erhöhung der Kopienzahl aller Isopentenol-Stoffwechselweg-Komponenten die Titer weiter verbessern würde. Aus der Bibliothek der manipulierten Stämme mit genomisch integrierten und erweiterten Isoprenoid-Stoffwechselweg-Komponenten produzierte der beste Stamm 344 mg/mL Isopentenol wenn kein Selektionsdruck vorlag.

Kapitel vier konzentriert sich auf das Metabolic Engineering des Fettsäurebiosynthesewegs zur effizienten Produktion von Fettalkoholen in E. coli. Aufgrund der engen Regulation des endogenen Fettsäurebiosynthesewegs wurden die wachstumsrelevanten Gene mittels CRISPR-Cas9 aus dem Genom entfernt und auf einem replizierbaren und repressiblen bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) platziert. Ein weiteres BAC-Modul, bestehend aus einem heterologen Stoffwechselweg für die Produktion von Fettalkoholen, wurde eingeführt. Es wurde bestätigt, dass sich diese beiden Module im defragmentierten Genom orthogonal und unabhängig voneinander verhalten. Das BAC-A-Modul wurde eingeführt, um das Zellwachstum in Abwesenheit von nativen Genen zu unterstützen, die Hauptfunktion des BAC-B-Moduls war die Expression von Genen des heterologen Stoffwechselweges zur Produktion hoher Titer von Fettalkoholen. CRISPR-Cas9 wurde für die gleichzeitige Multigen-Deletion von siebenundzwanzig wachstumsrelevanten nativen Stoffwechselwegen entwickelt. Ein daraus resultierender Stamm mit defragmentiertem Genom, der BAC-A und BAC-B beherbergt, wurde unter verschiedenen Expressions- und Repressionsbedingungen auf Fettalkohole getestet und schnitt 2,5-mal besser ab als ein manipulierter nicht-FABIO-Stamm (der aus BAC-B besteht, ohne die wachstumsrelevanten Gene zu unterdrücken).