Die menschliche Embryonalentwicklung ist aus technischen und vor allem aus ethischen Gründen sehr schwer zu untersuchen. Die Etablierung und einfache Erzeugung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) durch Reprogrammierung leicht zugänglicher somatischer Zellen, z. B. Fibroblasten, hat ganz neue Möglichkeiten zur Untersuchung der menschlichen Entwicklung in 2D- und 3D-Zellkultursystemen eröffnet. Reporter-hiPSC-Linien, die die Expression von Markergenen über die Produktion fluoreszierender Reporterproteine anzeigen, ermöglichen die Visualisierung von Entwicklungsprozessen innerhalb hiPSC-abgeleiteter Zellkultursysteme. Beispielsweise können das Auftreten bestimmter Zelltypen und Änderungen der zellulären Organisation von Gewebebereichen mit solchen Linien beobachtet werden, ohne dass die Zellen fixiert und Genprodukte beispielsweise mittels Antikörperfärbungen oder RNA-in-situ-Hybridisierung nachgewiesen werden müssen.

In dieser Doktorarbeit wurden fünf verschiedene Reporterstammzelllinien – drei mit einem und zwei mit zwei integrierten Reporterkonstrukten – hergestellt (OTX2-EGFP, OTX2-mKate2, OTX2-EGFP/GBX2-mKate2, OTX2-mKate2/GBX2-EGFP und DLX2-mKate2), um frühe Prozesse der humanen Gehirnentwicklung in dreidimensionalen Zellaggregaten zu untersuchen und zu visualisieren. Die Expressionsprodukte der Gene OTX2, GBX2 und DLX2 stellen Marker für regionsspezifische neurale Vorläuferzelltypen dar. Expressionskassetten für fluoreszierende Reporterproteine (EGFP oder mKate2), welche die Expression von OTX2, GBX2 und DLX2 anzeigen, wurden in die entsprechenden endogenen Loci mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems eingebracht.

Die Integration und Anzahl der editierten Allele wurden mittels PCR, Southern-Blot-Analyse und DNA-Sequenzierungen untersucht. Immunfärbungen wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Muster der zytosolischen Reporterproteine mit denen der endogenen nukleären Proteine übereinstimmen. Die Einzel- und Doppelreporterstammzelllinien wurden verwendet, um räumliche und zeitliche Reporterexpressionsmuster in neural-induzierten oder neural-induzierten und regionalisierten Embryoid Bodies (EBs) zu untersuchen. Die Regionalisierung der EBs wurde durch Behandlung der Aggregate mit Molekülen erreicht, welche bestimmte Morphogensignalwege aktivieren oder inhibieren. Auf diese Weise wird die Entwicklung der Zellen in EBs gesteuert und es entstehen Zellverbände, die vorwiegend aus neuralen Vorläuferzellen einer bestimmten Gehirnregion bestehen. Die beobachteten Expressionsmuster der Reporterkassetten in neural-induzierten oder neural-induzierten und regionalisierten EBs stimmen mit veröffentlichten Expressionsdaten der entsprechenden endogenen Gene in Säugetierembryonen und in differenzierten Säugetier-PSCs überein.

Hohe OTX2-Expressionsniveaus wurden in EBs detektiert, welche mithilfe einer zweifachen SMAD-Hemmung neural-induziert und dadurch hauptsächlich zu Gewebe des dorsalen Vorderhirns entwickelt wurden. Um eine starke Aktivierung der GBX2-Reporterexpression in gesamten EBs und gleichzeitig eine starke Reduktion der OTX2-Reporterexpression zu erreichen, war es notwendig die Zellaggregate neural zu induzieren und zusätzlich für circa eine Woche mit hohen Konzentrationen (3 µM) des WNT-Signalweg-Aktivators CHIR99021/CT99021 (CT) zu behandeln. Auf diese Weise wurde die Entwicklung der neural-induzierten Zellen zu Vorläuferzellen mit Hinterhirn-Identität in den EBs gesteuert. Je früher die CT-Behandlung begonnen wurde, desto schneller wurde eine solche Kaudalisierung der Zellen in neural-induzierten EBs erreicht. Wurden die neural-induzierten EBs mit CT-Konzentrationen ≤ 1 µM behandelt, entstanden eher Vorläuferzellen des Vorderhirns bzw. Mittelhirns. Eine sehr starke DLX2-Expression konnte in EBs detektiert werden, die mit Smoothened Agonist (SAG), einem Aktivator des SHH-Signalwegs, behandelt wurden. Um eine hohe DLX2-Expression zu erreichen und eine Ventralisierung des gesamten Zellverbands zu erzielen, war es ausreichend, neural-induzierte EBs mit 0.5 µM SAG für einen Tag oder mit 0.25 µM SAG für die Dauer von sieben Tagen zu behandeln.

Obgleich noch letzte experimentelle Schritte notwendig sind, um drei der fünf erzeugten Linien vollständig zu charakterisieren, wurden in dieser Arbeit sehr wertvolle zelluläre Werkzeuge hergestellt und validiert, die die kontrollierte Regionalisierung und die Untersuchung der Entwicklung von menschlichem Hirngewebe in Zellkultur erheblich erleichtern.

Mit den erstellten Reporterstammzelllinien können die Musterbildung embryonaler Gehirnstrukturen und die räumliche und zeitliche Expression der Gene OTX2, GBX2 und DLX2 in hiPSC-abgeleiteten Zellkultursystemen untersucht werden.