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Metabolic engineering and adaption of Saccharomyces cerevisiae for biotechnological applications

Höler, Sebastian (2021)
Metabolic engineering and adaption of Saccharomyces cerevisiae for biotechnological applications.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00019678
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Metabolic engineering and adaption of Saccharomyces cerevisiae for biotechnological applications
Language: English
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Bertl, Prof. Dr. Adam
Date: 2021
Place of Publication: Darmstadt
Collation: III, 148 Seiten
Date of oral examination: 18 November 2021
DOI: 10.26083/tuprints-00019678
Abstract:

Yeasts have been used for decades as cellular platforms for various biotechnological applications. They are “generally regarded as safe” (GRAS) unicellular eukaryotic microorganisms, which undergo rapid and robust growth allowing straightforward handling and production of many functional eukaryotic proteins. The pairing of simple genetic manipulation together with direct functional screening assays furthermore provides versatile applications of yeast in metabolic and protein engineering. The combination of selection and screening assays with randomly mutated libraries furthermore offer the possibility of altering and probing the function of proteins of interest.

This dissertation reports in five chapters applications of metabolic engineering in S. cerevisiae with the goal of tailoring these yeast cells for biotechnological applications.

Chapter I reports the engineering of retinal-synthesis in a K+ uptake deficient trk1Δ/trk2Δ yeast strain. This strain should be employed as a simple cellular platform for the functional expression of rhodopsin-based channel proteins. Growth rescue experiments with this strain are possible, since these yeasts cannot grow in standard low potassium medium, due to a deletion of the major potassium uptake systems (Trkp1p and Trk2p). The data show that an entire metabolic pathway for retinal synthesis can be introduced in this yeast strain. Growth assays in liquid medium reveal the functionality of a channelrhodopsin-2 variant, a cation channel which requires retinal for its function. Yeast growth is observed in a blue light-dependent manner in standard low potassium medium, demonstrating that the cells express a blue light-dependent K+ conductance. In complementary experiments also blue light-dependent growth inhibition was observed in a medium with high NaCl concentrations, indicating that the blue light-activated channelrhodopsin allows Na+ influx, which results in high intracellular Na+ accumulation and eventually in growth inhibition.

Chapter II describes a system in which a K+ uptake deficient trk1Δ/trk2Δ yeast strain is used as a platform to explore blue light-triggered expression of heterologous proteins. For this purpose a CRY2-CIB1-based light-activated transcription system was used in order to trigger expression of the small viral potassium channel KcvPBCV-1 in this K+ uptake deficient yeast. The data indicate that this system is able to generate light-triggered K+ uptake, resulting in growth restoration of this yeast strain in low potassium medium. In combination with a microfluidic system it was possible to monitor the expression kinetics of the channel after blue light stimulation. This kinetic analysis revealed that the channel protein production in cells occurred already within 15 20 minutes after stimulation.

In Chapter III the same trk1Δ/trk2Δ yeast system and rescue experiments were used to test a putative channel function of the envelope protein of SARS-CoV-2 (EpSARS CoV 2). Growth assays show that expression of EpSARS-CoV-2 is able to restore yeast growth in a low potassium medium. These data, in combination with luminometric measurements, support the view that EpSARS-CoV-2 exhibits cation conductance, mainly for K+ and presumably also for Ca2+. The presented growth assay can be used to screen for inhibitors of EpSARS CoV 2.

Chapter IV describes the development of novel auto-selection systems, based on the use of essential genes (OLE1 or CDC19) as selection markers. This strategy enables stable and robust selection of transformed yeasts in complex media, such as YPD. The host strains (ole1Δ or cdc19Δ) can be grown in complex medium supplemented with the low-cost compounds oleic acid (for ole1Δ) or lactic acid (for cdc19Δ), thus allowing easy culturing and handling prior to transformation. Upon transformation with DNA/plasmids containing the markers OLE1 or CDC19, transformants can be stably selected and propagated in complex medium without supplementation. These auto-selection systems might be useful for high volume applications, since this reduces expenses on medium and supplements such as antibiotics. A quantitative analysis indicated a near 100% retention of OLE1- and CDC19-based plasmids in complex YPD or SD medium.

In the last chapter, Chapter V, a yeast-based screen was developed for the identification of potential inhibitors for Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi stearoyl-CoA desaturases (SCDs), which provide a promising drug target for treating Trypanosoma infections. The ole1Δ yeast strain from the previous chapter cannot produce unsaturated fatty acids and can therefore not grow without supplementation of oleic acid. Plasmid based expression of either the endogenous S. cerevisiae SCD OLE1 or the Trypanosoma SCDs allows growth of the ole1Δ strain in standard yeast medium (YPD or SD). Reduction of the activity of Ole1p or either of the heterologously expressed SCDs, either by reduced expression or by inhibition of the proteins, results in a decreased content of unsaturated fatty acids, which leads to flocculation and growth inhibition of yeast. By testing three compounds, Cay 10566, SCD1 inhibitor A-939572 or PluriSIn 1, that showed inhibition of human SCDs, the present yeast-based screen identified strong differences in the potency of the potential inhibitors. Cay 10566, which has been shown to inhibit human and mouse SCD1, had no effect on either of the SCDs, while SCD1 inhibitor A-939572 and PluriSIn 1 showed strong inhibition of Ole1p and even stronger inhibition of the Trypanosoma SCDs. Therefore, the yeast system can be used to screen for and identify selective inhibitors of the Trypanosoma stearoyl-CoA desaturases, thus providing a basis for developing drugs for treatment of trypanosomiasis.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Hefen gehören zur Abteilung der Ascomycota und werden seit Jahrzehnten als zelluläre Plattformen für verschiedene biotechnologische Anwendungen genutzt. Sie sind einzellige eukaryotische Mikroorganismen, die schnell und robust wachsen und eine unkomplizierte Handhabung und Produktion vieler funktioneller eukaryotischer Proteine ermöglichen. Die Kombination von einfacher genetischer Manipulation mit direkten funktionellen Screening-Assays ermöglicht darüber hinaus vielseitige Anwendungen von Hefe im Metabolic- und Protein Engineering. Die Kombination von Selektions- und Screening-Assays mit zufällig mutierten Protein Bibliotheken bietet darüber hinaus die Möglichkeit, die Funktion von gewünschten Proteinen zu verändern und zu untersuchen.

Diese Dissertation beschreibt in fünf Kapiteln Anwendungen des Metabolic Engineering in S. cerevisiae mit dem Ziel, diese Hefezellen für biotechnologische Anwendungen zu manipulieren und anzupassen.

Kapitel I beschreibt die Entwicklung eines Retinal synthetisierenden Hefestamms, der eine Defizienz in den K+-Aufnahmesystemen aufweist (trk1Δ/trk2Δ). Dieser Stamm soll als einfache zelluläre Plattform für die funktionelle Expression von Rhodopsin-basierten Kanalproteinen verwendet werden. Wachstumsversuche mit diesem Stamm sind möglich, da diese Hefen aufgrund einer Deletion der wichtigsten Kaliumaufnahmesysteme (Trkp1p und Trk2p) nicht in kaliumarmen Standardmedien wachsen können. Die Daten zeigen, dass ein vollständiger Stoffwechselweg für die Retinal-Synthese erfolgreich in diesen Hefestamm integriert werden kann. Wachstumsversuche in flüssigem Medium zeigen die Funktionalität einer Channelrhodopsin-2-Variante, einem Kationenkanal, der Retinal für seine Funktionalität benötigt. In kaliumarmem Standardmedium wird ein Hefewachstum in Abhängigkeit von blauem Licht beobachtet. Dies zeigt, dass die Zellen eine blaulicht-abhängige K+-Leitfähigkeit exprimieren. Ergänzende Experimente zeigen auch eine blaulicht-abhängige Wachstumshemmung in einem Medium mit hohen NaCl-Konzentrationen. Dies deutet darauf hin, dass die durch Blaulicht aktivierte Channelrhodopsin-2-Variante einen Na+-Einstrom ermöglicht, der zu einer hohen intrazellulären Na+-Akkumulation und schließlich zur Wachstumshemmung führt.

In Kapitel II wird ein System beschrieben, bei dem ein trk1Δ/trk2Δ-Hefestamm als Plattform für die Untersuchung einer durch Blaulicht aktivierten Expression heterologer Proteine verwendet wird. Zu diesem Zweck wurde ein CRY2-CIB1-basiertes Transkriptionssystem verwendet, um die Expression des kleinen viralen Kaliumkanals KcvPBCV-1 durch Blaulicht zu induzieren. Dieses System ist in der Lage, eine durch Licht induzierte K+-Aufnahme zu erzeugen, was zu einer Wiederherstellung des Wachstums dieses Hefestamms in kaliumarmem Medium führt. In Kombination mit einem mikrofluidischen System war es möglich, die Expressionskinetik des Kanals nach Blaulichtstimulation zu verfolgen. Diese kinetische Analyse ergab, dass die Produktion des Kanalproteins in den Zellen bereits innerhalb von 15 bis 20 Minuten nach der Stimulation einsetzte.

Das gleiche trk1Δ/trk2Δ-Hefesystem wurde in Kapitel III verwendet, um eine mutmaßliche Kanalfunktion des Hüllproteins von SARS-CoV-2 (EpSARS-CoV-2) durch Wachstumsversuche zu testen. Diese zeigen, dass die Expression von EpSARS-CoV-2 das Zellwachstum von trk1Δ/trk2Δ Hefen in kaliumarmem Standardmedium wiederherstellen kann. In Kombination mit luminometrischen Messungen, unterstützen diese Daten die These, dass EpSARS CoV 2 eine K+- und vermutlich auch eine Ca2+- Leitfähigkeit aufweist. Das vorgestellte Wachstumsassay kann für ein Screening nach Inhibitoren für EpSARS-CoV-2 verwendet werden. Kapitel IV beschreibt die Entwicklung neuartiger automatischer Selektionssysteme, die auf der Verwendung essentieller Gene (OLE1 oder CDC19) als Selektionsmarker beruhen. Diese Strategie ermöglicht eine stabile und robuste Selektion von transformierten Hefen in komplexen Medien wie YPD. Die Wirtsstämme (ole1Δ oder cdc19Δ) können in einem komplexen Medium kultiviert werden, das mit den kostengünstigen Verbindungen Ölsäure (für ole1Δ) oder Milchsäure (für cdc19Δ) angereichert ist, was eine einfache Kultivierung und Handhabung der Zellen vor der Transformation ermöglicht. Nach der Transformation mit DNA/Plasmiden, die die Marker OLE1 oder CDC19 enthalten, können die Transformanten stabil selektiert und in komplexem Medium ohne weitere Zusätze vermehrt werden. Diese automatischen Selektionssysteme könnten sich für industrielle Anwendungen als nützlich erweisen, da sie die Kosten für Medium und Zusatzstoffe wie Antibiotika reduzieren. Eine quantitative Analyse ergab eine nahezu 100%ige Retention der OLE1- oder CDC19-basierten Plasmide in komplexem YPD- oder SD-Medium.

Im letzten Kapitel, Kapitel V, wurde ein Screening auf Hefebasis entwickelt, um potenzielle Inhibitoren für Stearoyl-CoA-Desaturasen (SCDs) von Trypanosoma brucei und Trypanosoma cruzi zu identifizieren, die ein vielversprechendes Ziel für die Behandlung von Trypanosoma-Infektionen darstellen. Der ole1Δ-Hefestamm aus dem vorangegangenen Kapitel kann keine ungesättigten Fettsäuren produzieren und kann daher ohne eine Supplementierung von Ölsäure nicht wachsen. Die plasmidbasierte Expression entweder des endogenen S. cerevisiae SCD OLE1 oder der Trypanosoma SCDs ermöglicht das Wachstum des ole1Δ-Stammes in Standard-Hefemedium (YPD oder SD). Eine Einschränkung der Aktivität von Ole1p oder einer der heterolog exprimierten SCDs, entweder durch reduzierte Expression oder durch Hemmung der Proteine, führt zu einem verringerten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Dies resultiert in einer Ausflockung und Wachstumshemmung der Hefen. Beim Testen von drei Verbindungen, Cay 10566, SCD1 Inhibitor A-939572, oder PluriSIn 1, die eine Inhibition humaner SCDs zeigten, wurden bei dem vorliegenden Screening auf Hefebasis starke Unterschiede in der Wirksamkeit der potenziellen Hemmstoffe festgestellt. Cay 10566, das nachweislich die Humane und Murine-SCD1 hemmt, hatte keine Wirkung auf einen der SCDs, während SCD1 Inhibitor A-939572 und PluriSIn 1 eine starke Hemmung von Ole1p und eine noch stärkere Hemmung der Trypanosoma-SCDs zeigten. Daher kann das Hefesystem zum Screening und zur Identifizierung selektiver Inhibitoren der Stearoyl-CoA-Desaturasen von Trypanosoma verwendet werden und bietet somit eine Grundlage für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Trypanosomiasis.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-196788
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Membrane Biophyscis (20.12.23 renamed in Biology of Algae and Protozoa)
Date Deposited: 25 Nov 2021 13:29
Last Modified: 25 Nov 2021 13:30
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19678
PPN: 488956188
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