Die Hämophilie ist eine X-chromosomal vererbte Blutgerinnungsstörung und kann aufgrund des Mangels an Gerinnungsfaktor VIII oder FIX in die Hämophilie A respektive Hämophilie B unterschieden werden (129). Die Unterteilung in die Schweregrade schwer, moderat und mild beeinflusst sowohl die klinische Manifestation als auch die Langzeitprognose für die Patienten (214). Insbesondere bei der schweren Verlaufsform der Hämophilie wird eine prophylaktische Substitution der Patienten mit dem jeweiligen fehlenden Gerinnungsfaktor angestrebt, mit dem Ziel den Schwellenwert der Gerinnungsfaktorspiegel im Plasma stets über 1% zu halten und somit das Auftreten von spontanen Blutungen in Muskeln und Gelenke weitestgehend zu verhindern (57;199). Aufgrund der geringen Halbwertszeit von maximal 24 Stunden für FIX müssen sich die Patienten zwei- bis dreimal wöchentlich dieser Substitutionsprozedur unterziehen, was nicht nur eine Einschränkung der Lebensqualität zur Folge hat sondern darüber hinaus auch ein gesundheitliches Risiko darstellt (117;124). Daher wurde die Entwicklung einer Gentherapie zur Behandlung der Hämophilie in den letzten Jahren progressiv vorangetrieben. Die Hämophilie bietet dahingehend zweierlei Vorteile: zum einen handelt es sich um einen monogenetischen Defekt und zum anderen haben geringe Korrekturen der Gerinnungsfaktor Aktivitäten bereits einen enormen Einfluss auf die klinische Prognose für die Patienten. Das ursprüngliche Ziel, den Schwellenwert der Gerinnungsfaktor Aktivität über 1% zu halten, wurde bereits durch diverse Optimierungsprozesse, wie der Verwendung von selbstkomplementären und leberspezifischen AAV Serotypen, einer Kodon Optimierung des FIX Transgens und der Entwicklung von starken aber dennoch leberspezifischen Promotoren, erreicht. Hierdurch war es möglich mittels AAV Gentherapie in Hämophilie B Patienten bereits ein FIX Aktivitätsmaximum von 12% zu erreichen (132;150-154). Dieses Expressionsmaximum konnte zudem noch durch die Verwendung der sogenannten Padua Mutante des FIX Transgens gesteigert werden (69). Die Padua Mutation wurde erstmals 2009 von Simioni und Kollegen beobachtet und beschreibt genetisch die Substitution der Aminosäure Arginin gegen Leucin an Position 338, welches eine bis zu 8-fach gesteigerte FIX Aktivität trotz physiologischen Antigenspiegeln im Plasma zur Folge hat (196). Trotz der vielversprechenden Entwicklung der Gentherapie in Hinblick auf die erreichten FIX Aktivitäten sind neue, aus den präklinischen Studien in Tiermodellen nicht vorhersagbare Probleme aufgetreten. Hierzu zählt ein mit der AAV Gentherapie verbundener Anstieg an Transaminasen als Anzeichen einer Lebertoxizität. Als Ursache hierfür werden zurzeit zwei verschiedene Mechanismen diskutiert. Zum einen die Präsentation von Kapsid Strukturen über die MHC-I und MHC-II Komplexe und der damit einhergehenden Auslösung einer zytotoxischen T Zell Antwort gegen transduzierte Hepatozyten (84;135-138). Zum anderen eine Stressreaktion transduzierter Hepatozyten durch eine übermäßige Proteinexpression ausgelöst durch eine strikt perivaskulär limitierte Transduktion (132). Beide Mechanismen haben einen Zusammenhang mit der für die AAV Gentherapie verwendeten Vektordosis gemein. Daraus resultiert das momentane (Haupt)Bestreben die Vektordosis für die AAV Gentherapie weiter zu reduzieren ohne dabei den minimal notwendigen FIX Aktivitätsspiegel im Plasma zu verlieren. Aus diesem Grund wurden in diesem Labor zwei weitere hyperaktive FIX Mutanten generiert. Eine zusätzliche Aktivitätssteigerung um das 20-fache verglichen mit dem Wildtyp FIX Protein wurde durch den Austausch der Aminosäure Serin gegen Tryptophan an Position 377 erreicht (171) und fortan als FIX LW bezeichnet. Die FIX KLW Variante wurde durch den zusätzlichen Austausch der Aminosäure Valin gegen Lysin an Position 10 erweitert (30), die dadurch bedingte verminderte Kollagen Typ IV Bindungsaffinität konnte auch in dieser Arbeit mit einem Kollagen Typ IV Bindungs Assay bestätigt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit erfolgte die Generierung der für Proteinproduktion im großen Maßstab benötigten Zelllinien durch lentivirale Transduktion der HEK293T Zelllinie mit der jeweiligen FIX Variante als Transgen gefolgt von der Charakterisierung sowie Expansion geeigneter Zellklone. Die in vitro Charakterisierung dieser Zellklone zeigte zwar eine reduzierte Expression der mutierten FIX Varianten, was allerdings weder durch Sekretionsanalysen noch durch Untersuchungen zum intrazellulären Transport mechanistisch erklärt werden konnte. Auch der mittels SDS-PAGE sichtbar gemachte Glykosylierungsstatus schien quantitativ zwischen den FIX Proteinen vergleichbar gewesen zu sein. Die Aufreinigung der für die in vivo Experimente benötigten rekombinanten FIX Proteine wurden ebenfalls in dieser Doktorarbeit etabliert und erfolgte mittels Anionen-Austausch-Chromatographie. Funktionalitätsanalysen der rekombinanten FIX Proteine zeigten eine 5-fach gesteigerte Aktivität der Padua Variante gegenüber dem Wildtyp, wohingegen die FIX LW und FIX KLW Varianten eine zusätzliche Steigerung um das 7 bis 8-fache aufwiesen. Die Abwesenheit von durch die Aufreinigung verursachtem voraktiviertem FIXa konnte durch die Visualisierung der Proteine mittels Western Blot sowie die Anwendung eines chromogenen Assays gegen FIXa bewiesen werden. Durch die Veränderung der Proteinsequenz und der damit verbundenen möglichen Entstehung von neuen Epitopen wurde im nächsten Teil der Arbeit das immunogene Potential der FIX Varianten in zwei experimentellen Ansätzen untersucht. Die intramuskuläre Injektion der FIX Proteinvarianten in Hämophilie B Mäusen führte immunologisch zu keiner Reaktion. Erst die Kombination der FIX Proteinvarianten mit dem inkompletten Freundschen Adjuvans und der zweimaligen subkutanen Injektion führte zu einem drastischen Anstieg der FIX IgG1 Konzentration in den Mausplasmen. Es konnte zwar tendenziell sogar ein geringerer Anstieg der FIX IgG1 Konzentration bei den drei hyperaktiven Varianten im Vergleich zum Wildtyp FIX beobachtet werden allerdings ohne statistische Signifikanz, so dass zum aktuellen Stand von keiner gesteigerten Immunogenität durch die Einzelnukleotidaustausche auszugehen ist. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die pharmakokinetische Charakterisierung der FIX Proteinvarianten. Durch subkutane oder intravenöse Injektion der aufgereinigten FIX Proteine und retroorbitale Blutentnahme zu definierten Zeitinterwallen wurde sowohl die extravaskuläre Umverteilung als auch die Eliminierung der FIX Proteine aus dem Plasma von Hämophilie B Mäusen untersucht. Hierbei zeigte die KLW Variante aufgrund der verminderten Bindung an Kollagen TypIV und der damit verbundenen reduzierten extravaskulären Sequestrierung eine deutlich erhöhte Bioverfügbarkeit im Plasma sowohl nach subkutaner als auch intravenöser Injektion. Pharmakokinetische Analysen unter Annahme eines Zwei-Kompartimenten Systems zeigten hingegen eine deutlich gesteigerte Elimination der FIX KLW Variante aus dem Plasma, welches beispielsweise durch eine Halbwertszeit verlängerte Modifikation korrigiert werden könnte. Als letzten Teilaspekt in dieser Doktorarbeit wurden die neu generierten hyperaktiven FIX Varianten auf ihr Potential für ihren Einsatz in der Gentherapie hin untersucht. Die Überprüfung der Effizienz erfolgte unter Verwendung einer niedrigen Dosisstufe mit 5x1010 vg/kg. Die errechnete spezifische Aktivität ergab eine 5-fach gesteigerte Aktivität der Padua Variante verglichen mit dem FIX Wildtyp. Die Verwendung der FIX LW und KLW Variante als Transgen resultierte sogar in einer 14- fach gesteigerten spezifischen Aktivität verglichen mit dem Wildtyp. Auffällig war auch in diesem Teilabschnitt die verminderte Proteinexpression der hyperaktiven FIX Proteinvarianten im Vergleich zum Wildtyp, dies konnte allerdings mit den in dieser Arbeit erhobenen Daten mechanistisch nicht begründet werden. Die Verwendung einer hohen Dosisstufe mit 2x1011 vg/kg sollte Rückschlüsse auf eine mögliche erhöhte Thrombogenität ausgelöst durch die Hyperaktivität liefern. Dies konnte allerdings mit Bestimmung der Konzentration an D-Dimeren und Thrombin-Antithrombin-Komplexen in Plasmen gentherapierter Hämophilie B Mäuse als nicht relevant bestätigt werden. Es konnte auch keine erhöhte Immunogenität der FIX Varianten in gentherapiertet Mäuse nachgewiesen werden, sodass die hyperaktiven Varianten LW und KLW diesbezüglich sicher zu sein scheinen und in der AAV Gentherapie getestet werden können. Des Weiteren ist der Einsatz der FIX KLW Variante für die Etablierung einer subkutan zu applizierenden Substitutionstherapie denkbar, vergleichend mit dem zurzeit in klinischen Studien getesteten Dalcinonacog alpha (NCT03995784).