In den letzten Jahren wurden zunehmend Protease-basierte Sensoren und Schalter für die Konstruktion künstlicher Signalfunktionen in der synthetischen Biologie entwickelt und eingesetzt. Obwohl diese in vitro umfassend charakterisiert wurden, existieren nur wenige robuste und quantitative Assays zur Charakterisierung von Proteasen in vivo. Dies betrifft insbesondere Assays, die kinetische Echtzeitdaten zur apparenten Aktivität von Proteasen und Protease-basierten Sensoren und Schaltern unter Beibehaltung der Genotyp-Phänotyp-Kopplung in E. coli liefern können und mit Hochdurchsatz-Screeningformaten kompatibel sind. Um diesen Einschränkungen zu begegnen, wurden im Verlauf des Projekts verschiedene Protease-Sensordesigns mit verschiedenen Arten von fluoreszierenden Proteinreportern entwickelt und getestet. Protease-spaltbare Abbau-Tags (Degrons) wurden als der beste Weg identifiziert, um das fluoreszierende Ausgangssignal durch proteolytische Aktivität in E. coli direkt zu modulieren. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Testmodi erfolgreich etabliert: Der erste Testmodus basiert auf einer herkömmlichen positiven Auslesung, bei der das Fluoreszenzsignal proportional zur Proteaseaktivität ansteigt, während der zweite Modus verbesserte quantitative Daten basierend auf einem ratiometrischen Zweifarben-Assay liefert. Der Assay wurde mit dem nuclear inclusion protein a (NIa) des Tabakadernscheckungs-Virus (engl: tobacco vein mottling virus; kurz: TVMV) validiert, während der allgemeine Nutzen des Assays zusätzlich mit der NIa-Protease des Tabakätzvirus (TEV) und dem NS3-Protein des Hepatitis-C-Virus (HCV) validiert wurde. Schließlich wurde der Assay für das vorläufige Screening einer Bibliothek von optisch schaltbaren selbst-inhibierten TVMV-Kandidaten verwendet.