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Many different routes for targeted gene expression are available and with the help of Synthetic Biology (SynBio), more and more controlled expression systems are developed every year aimed at robustly and precisely switching one or more genes on and off (1). Targeted repression and expression are essential for basic research, as well as for many industrial applications. In this context the unicellular eukaryote S. cerevisiae is one of the oldest and most commonly used hosts (2,3). Despite the fact, that S. cerevisiae has been investigated extensively for many years, researchers are still lacking easy-to-implement and well-organized toolboxes (3). In addition, many frequently used regulatory systems influence the viability of the host cell, show high basal expression or enable only the overexpression of the target gene without the possibility of fine regulation (4).
Within this work, a modular system for targeted gene expression was designed, implemented and extensively characterized to overcome these limitations. Additionally, it was aimed to contribute to and therefore improve the already existing publicly available yeast toolbox. A scaffold RNA (scRNA) CRISPR/dCas9 system served as a modular expression platform (5). This is based on three components namely dCas9, the RNA-binding protein MCP fused to the transcriptional activation domain VP64 and a scRNA encoding the desired locus and action. A scRNA specifically targeting a tetO binding sequence was used, resulting in Venus reporter gene expression. The functionality of the reporter gene setup was demonstrated by the expression of the reporter gene Venus.
A natural switch was integrated based on the well-established Gal10 expression cassette by implementation of a GAL promoter in front of dCas9. High expression levels were achieved, but comparatively high basal expression was observed. Hence, a second switch based on the synthetic LexA-ER-AD heterologous transcription factor was added. A functional AND gate was achieved by implementing four β-estradiol (ES) inducible lexA boxes in front of MCP-VP64. The AND gate was demonstrated to achieve high expression rates in presence of galactose and ES while being tightly regulated in their absence. Additionally, a reporter gene setup was implemented combining a gene of interest (GOI) with the fluorophore tGFP by the ribosomal skipping T2A sequence. This setup allows to adapt the system to any gene of interest without losing reporter function. To extend the possibilities for applications, a positive feedback loop was designed and verified as functional.
The modularity of the system was demonstrated by the construction of a second AND gate, in which the scRNA was placed under the control of ES. For this purpose, a ribozyme-scRNA-ribozyme construct was introduced and its functionality verified for both, a constitutive promoter and an ES inducible promoter. The established switches and AND gates were characterized in detail for their expression levels, basal activity and their dose-dependency. A better understanding of the underlying principles and the functioning of the AND gate design was achieved by backing up of the experimental findings with the development of a mathematical model and single-cell analysis. In summary, a predictable and modular, as well as versatile expression control system was developed. |
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Über die letzten Jahre wurde eine große Anzahl verschiedener Verfahren entwickelt, die eine gezielte und induzierbare Genexpression ermöglichen. Diese Systeme kommen in einer Vielzahl von Feldern zur Anwendung. Hierzu gehören unter anderem die Bereiche akademische Forschung sowie industrielle Produktion. Ein beliebter Modellorganismus ist die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Obwohl der Einzeller S. cerevisiae bereits seit vielen Jahren erfolgreich verwendet wird, besteht immer noch ein großer Bedarf an öffentlich zugänglichen und gut charakterisierten genetischen Schaltern. Besonders im Bereich der Expressionskontrolle besteht weiterer Forschungsbedarf, denn viele etablierte Systeme erlauben keine konzentrationsabhängige Induktion, sind in einem gewissen Maße toxisch für den Organismus oder weisen eine hohe basale Expression auf.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich daher mit dem Design, der Implementierung und der Charakterisierung modularer Schalter in S. cerevisiae. Hierfür dient ein modifiziertes CRISPR/dCas9 System als Grundlage. Die dabei verwendete scaffold RNA (scRNA) ist um ein RNA-Bindemodul verlängert, welches von dem RNA-bindenden Fusionsprotein MCP-VP64 erkannt wird und nach Bindung eine Transkriptionsinitiation auslöst. Das verwendete CRISPR/dCas9 ermöglicht also die modulare Expressionskontrolle der drei Komponenten dCas9, MCP-VP64 und scRNA. Ziel dieser Arbeit war es, alle drei CRISPR/dCas9 Komponenten unabhängig voneinander induzieren zu können und im Anschluss die einzelnen Komponenten zu einem UND-Gatter zu kombinieren.
Um einen ersten Schalter zu generieren, wurde die Expression des dCAS9-Proteins unter Kontrolle des GAL Promotors gebracht, was zu einer Galactose-abhängigen Induktion der Expression des fluoreszierenden Reporterproteins Venus führte. Der Galactose-Schalter ermöglichte hohe Expressionsraten, was jedoch auch eine verhältnismäßig hohe basale Expression mit sich brachte. Daher wurde ein funktionelles logisches UND-Gatter entworfen, bei dem MCP-VP64 unter die Kontrolle von β-Estradiol (ES) gebracht wurde. Nur bei Anwesenheit beider Induktoren wurde eine Expression des Reportergens gemessen. Dies zeigt, dass ein streng reguliertes, sowie konzentrationsabhängiges UND-Gatter entwickelt wurde. Zusätzlich zu Venus als Reportergen wurde ein zweites Reporter-Konstrukt zur regulierten Expression von Proteinen mit biotechnologischer Relevanz evaluiert. Hierfür wurde das Zielgen durch ein so genanntes T2A Peptid mit dem Fluorophor tGFP verbunden, wodurch die Expression beider Gene in einem mRNA Transkript, sowie die direkte Detektion der Expression ermöglicht wurde. Um die Möglichkeiten der Toolbox zu erweitern, wurde zusätzlich ein positiver Feedback Mechanismus untersucht.
Das verwendete System wurde außerdem um eine induzierbare scRNA erweitert. Hierfür wurde ein Ribozym-scRNA-Ribozym Konstrukt implementiert und sowohl mit einem konstitutiven als auch mit dem ES-induzierbaren Promotor getestet. Alle verwendeten Schalter und Gatter wurden auf ihr Expressionslevel, ihre basale Expression und Konzentrationsabhängigkeit getestet. Um ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Prinzipien und der Funktionsweise des UND-Gatter Designs zu erhalten, wurden die experimentellen Ergebnisse durch die Entwicklung eines mathematischen Modells und einer Einzelzellanalyse erweitert. Mit dieser Arbeit wurde ein vorhersehbares, modulares und vielseitig einsetzbares Expressionskontrollsystem entwickelt. | German |
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