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Surface-Driven RNA Refolding by the OB-Fold Proteins of the Trypanosoma brucei Editosome

Voigt, Christin (2017)
Surface-Driven RNA Refolding by the OB-Fold Proteins of the Trypanosoma brucei Editosome.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication

Copyright Information: CC BY-NC-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution NonCommercial, ShareAlike.

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Surface-Driven RNA Refolding by the OB-Fold Proteins of the Trypanosoma brucei Editosome
Language: English
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Date: 2017
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 5 April 2017

RNA editing in African trypanosomes is an essential mitochondrial RNA processing reaction. It is required to decode otherwise untranslatable primary transcripts. The reaction is characterized by the insertion and/or deletion of, in several transcripts, hundreds of uridylyl residues. It relies on a specific class of small, non-coding RNA molecules, known as guide (g)RNAs. Guide RNAs act as templates in the process. They base-pair to the highly structured pre- and partially edited mitochondrial mRNAs before a multi-protein complex, the 20S editosome, catalyzes the individual steps of the RNA editing cycle. The 20S editosome executes a chaperone-like RNA remodeling activity. The activity acts on the pre-edited transcripts by enhancing the structural dynamics of primarily U-nucleotides in order to "loosen" the structure of the pre-mRNA substrate molecules.

In chapter II, I present an in vitro assay, to experimentally monitor the consequences of the RNA chaperone activity for the entry of gRNAs. The assay uses short, gRNA-mimicking DNA oligonucleotides (gDNA) and probes the formation of gDNA-pre-mRNA hybrid molecules by ribonuclease H (RNaseH) digestion. The data demonstrate that the RNA chaperone activity stimulates the formation of gDNA/pre-mRNA hybrids thereby acting as an early facilitator of the editing reaction.

The molecular nature of the editosome-inherent RNA chaperone activity is unknown. In chapter III, I test the hypothesis, that the oligonucleotide/oligosaccharide binding (OB)-fold proteins of the editosome are responsible for the activity. Importantly, these proteins are predicted to be in large parts intrinsically disordered. Furthermore, experimental evidence suggests that the proteins form a, structurally important, clustered subdomain within the editosome. To examine their potential chaperone activity I expressed the different proteins as recombinant polypeptides, both, as full-length and as OB-fold-only constructs. I verified the disorder prediction by circular dichroism (CD)-spectroscopy and analyzed their homo- and hetero-oligomerization behavior by size exclusion chromatography. Importantly, all OB-fold protein constructs show RNA chaperone activity with half maximal activities in the nM concentration range. The measured activities directly correlate to the surface areas of the different protein complexes suggesting that the RNA remodeling process is mainly surface-driven. The analysis of the induced RNA structure changes was performed with nucleotide resolution using selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). The experiments demonstrate that the effect of the homo-oligomeric OB-fold protein complexes is qualitatively and quantitatively similar to the effect of 20S editosomes. The data further suggest an involvement of the intrinsically disordered protein regions. A coarse grained structural model of the 20S editosome is presented, which supports a preferential positioning of disordered protein domains on the surface of the complex and of ordered protein regions in the core of the editosome.

An analysis, to address possible RNA substrate and nucleotide specificities of the OB-fold protein-mediated RNA chaperone activity, is presented in chapter IV. For that RNaseH-based gDNA annealing assays were performed comparing the OB-fold of the editosome protein TbMP24 with 20S editosomes. Two different mito-chondrial transcripts were used in the analysis: the pre-mRNA encoding ribosomal protein S12 (RPS12) and the pre-mRNA for apocytochrome b (CYb). I analyzed the RPS12 transcript at ten different regions of different structure and sequence contexts. The experiments demonstrate that both, TbMP24-OB and 20S editosomes, enhance the accessibility of a pre-mRNA for gDNA entry at every position in the RNA. The TbMP24-OB activity shows no preference for distinct RNA structures, but a preference for U-rich sequence regions. This U-preference was confirmed by SHAPE-experiments of the RPS12-RNA with TbMP24-OB. Both TbMP24-OB and 20S editosomes act on both transcripts, with a slightly higher activity on the larger CYb-RNA. TbMP24-OB thereby shows the same overall substrate preference as 20S editosomes, which enables the protein to function as a model protein for studying the RNA chaperone activity of the 20S editosome.

RNA editing is differentially regulated throughout the lifecycle of Trypanosoma brucei, but the cause of that differential editing is unknown. The intracellular location of RNA editing, the mitochondrion, differs in the lifecycle stages, ultimately generating two different redox environments. In chapter V, I test whether the edito-somal OB-fold proteins can serve as "redox switches". I uncovered that some of the OB-fold proteins of the editosome are sensitive towards changes in the redox environment, leading to altered thermal stabilities and altered oligomerization characteristics. To investigate the effects of oxidation on protein oligomerization, I mutated the cysteine codons in the TbMP24-OB-coding gene. The exchange of all cysteines by alanines resulted in a mutated protein with an altered oligomerization behavior. The mutations cause an inability to switch the oligomerization state, resulting in a protein variant that stays dimeric, comparable to the wild-type protein in its reduced form. The interaction with the binding partner TbMP18 is not hindered by the cysteine mutations, but the ratio of interacting proteins is altered. These findings have implications for the assembly of the editing complex in vivo, suggesting that cysteine thiol redox switching could be a mechanism to regulate editing in a lifecycle-dependent manner.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

RNA-Editing in afrikanischen Trypanosomen ist eine essenzielle RNA-Prozessierungsreaktion. Sie wird benötigt, um mitochondriale Primärtranskripte, die sonst nicht translatierbar wären, zu entschlüsseln. Die RNA-Editing-Reaktion ist durch das Einfügen und/oder Entfernen von, in einigen Fällen hunderten, Uridylatresten gekennzeichnet. Sie ist auf eine spezifische Klasse von kleinen, nicht-kodierenden RNA-Molekülen angewiesen, die guide (g)RNAs. Die gRNAs stellen die Vorlage für diesen Prozess dar. Sie bilden Basenpaare mit den hochstrukturierten mitochondrialen prä- und partiell edierten mRNAs, bevor ein Multiproteinkomplex, das 20S Editosom, die einzelnen Schritte des RNA-Editing-Zyklus katalysiert. Das 20S Editosom führt eine chaperonartige RNA-Strukturumformung durch. Diese Aktivität wirkt auf prä-edierte Transkripte, wobei die strukturelle Dynamik, primär von U-Nukleotiden, erhöht wird, um die Struktur dieser Substrat-RNAs "aufzulockern".

In Kapitel II präsentiere ich ein in vitro Testsystem, um die Konsequenzen der RNA-Chaperonaktivität auf die Bildung des prä-mRNA-gRNA-Hybrids zu untersuchen. In diesem Testsystem verwende ich kurze, gRNA nachahmende, DNA-Oligonukleotide (gDNA) und weise die Bildung von gDNA/prä-mRNA-Hybriden durch den Verdau mittels Ribonuklease H (RNaseH) nach. Die Daten zeigen, dass die RNA-Chaperonaktivität die Bildung von gDNA/prä-mRNA-Hybriden stimuliert. Damit ermöglicht die RNA-Chaperonaktivität die darauffolgende RNA-Editing-Reaktion.

Die molekulare Ursache der Editosom-inhärenten RNA-Chaperonaktivität ist unbekannt. In Kapitel III über-prüfe ich die Hypothese, dass die Proteine des Editosoms, die ein Oligonukleotid/Oligosaccharid Bindemotif (OB-fold) besitzen, verantwortlich für diese Aktivität sind. Vorhersagen deuten darauf hin, dass diese Proteine in großen Teilen intrinsisch unstrukturiert sind. Weiterhin belegen Experimente, dass diese Proteine eine strukturell wichtige Subdomäne innerhalb des Editosoms bilden. Um die RNA-Chaperonaktivität der Proteine zu untersuchen, habe ich sie als rekombinante Polypeptide hergestellt, sowohl als Konstrukt in voller Länge, als auch als Konstrukt welches nur aus dem OB-fold besteht. Ich bestätigte die Vorhersage der unstrukturierten Proteinbereiche mittels Circulardichroismus-Spektroskopie und analysierte das Homo- und Hetero-Oligomerisierungsverhalten durch Größenausschluss-Chromatographie. Alle OB-fold-Proteinkonstrukte zeigen eine RNA-Chaperonaktivität mit halbmaximalen Aktivitäten im nM Konzentrationsbereich. Die gemessene Aktivität korreliert direkt mit der Oberfläche der unterschiedlichen Proteinkomplexe, was darauf hindeutet, dass der Prozess hauptsächlich durch die Proteinoberflächen bedingt ist. Die Analyse der induzierten RNA-Strukturänderungen wurde mit Nukleotidauflösung mittels Selective 2’-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension (SHAPE) durchgeführt. Die Experimente zeigen, dass der Effekt der homooligomeren OB-fold Proteinkomplexe qualitativ und quantitativ dem Effekt von 20S Editosomen entspricht. Des Weiteren deuten die Daten darauf hin, dass intrinsisch unstrukturierte Proteinregionen involviert sind. Ein grobgranulares Strukturmodell des 20S Editosoms wird präsentiert, das die präferenzielle Anordnung dieser Bereiche an der Oberfläche des Komplexes und die Anordnung von strukturierten Bereichen im Kern des Komplexes unterstützt.

Eine Analyse, die mögliche RNA-Substrat- und Nukleotidpräferenzen der OB-fold vermittelten RNA-Chaperon-aktivität betrachtet, wird in Kapitel IV gezeigt. Dafür wurden Experimente mit dem RNaseH-basierten gDNA Anlagerungstestsystem durchgeführt, die den OB-fold des editosomalen Proteins TbMP24 und 20S Editosomen vergleichen. Zwei unterschiedliche mitochondriale Transkripte wurden in dieser Analyse verwendet: die prä-mRNA, die für das ribosomale Protein S12 (RPS12) kodiert und die prä-mRNA für Apocytochrom B (CYb). Ich analysierte das RPS12 Transkript an zehn verschiedenen Positionen, die unterschiedliche Sequenz- und Strukturmerkmale aufweisen. Die Experimente zeigen, dass sowohl TbMP24-OB als auch 20S Editosomen die Zugäng¬lichkeit der prä-mRNA für die Anlagerung der gDNA an jeder Position der RNA erhöhen. Die TbMP24-OB-Aktivität zeigt keine Präferenz für bestimmte Strukturmerkmale, jedoch eine Präferenz für U-reiche Regionen. Die U-Präferenz wurde mittels SHAPE-Experimenten, der RPS12-RNA mit TbMP24-OB, bestätigt. Sowohl TbMP24-OB als auch 20S Editosomen zeigen eine Aktivität auf beiden Transkripten, mit einer leicht erhöhten Aktivität auf der größeren CYb-RNA. Somit hat TbMP24-OB die gleichen Substratpräferenzen wie das 20S Editosom. Damit kann es als Modellprotein verwendet werden, um die RNA-Chaperonaktivität des 20S Editosoms zu untersuchen.

RNA-Editing ist während des Lebenszyklus von Trypanosoma. brucei differenziell reguliert, jedoch ist die Ursache dafür unbekannt. Der intrazelluläre Ort an dem RNA-Editing stattfindet, das Mitochondrion, unterscheidet sich während der unterschiedlichen Stadien des Lebenszyklus, was zu zwei verschiedenen Redox-Umgebungen führt. In Kapitel V untersuche ich, ob die OB-fold Proteine des Editosoms, als "Redox-Schalter" dienen können. Ich zeige, dass einige der OB-fold Proteine des Editosoms sensitiv gegenüber einer Veränderung der Redox-Umgebung sind, was zu einer veränderten thermischen Stabilität und zu einem veränderten Oligomerisierungsverhalten führt. Um die Effekte der Oxidation auf die Protein¬oligomerisierung zu untersuchen, mutierte ich die Cystein-Codons des TbMP24-OB-kodierenden Gens. Der Austausch aller Cysteine durch Alanine, führt zu einem mutierten Protein, das ein verändertes Oligomerisierungsverhalten aufweist. Die Mutationen führen dazu, dass die Proteinvariante ihren Oligomerisierungszustand nicht mehr ändert und als Dimer, vergleichbar mit dem Wildtypprotein in seiner reduzierten Form, bestehen bleibt. Die Interaktion mit dem Bindepartner TbMP18 ist durch die Cysteinmutationen nicht beeinträchtigt, jedoch ist das Verhältnis der beiden interagierenden Proteine im Komplex verändert. Diese Erkenntnisse sind von Bedeutung für die Assemblierung des Editing-Komplexes in vivo, was darauf hindeutet, dass Redox-Schalter in die Regulation des RNA-Editings, in Abhängigkeit vom Lebenszyklus, involviert sein können.

URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-61851
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 500 Science
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Molecular Genetics
10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
Date Deposited: 02 May 2017 12:58
Last Modified: 02 May 2017 12:58
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6185
PPN: 402704991
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