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Molecular epitope and affinity determination of protein-protein interactions by a combination of biosensor and mass spectrometric methods

Wiegand, Pascal (2024)
Molecular epitope and affinity determination of protein-protein interactions by a combination of biosensor and mass spectrometric methods.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026779
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Molecular epitope and affinity determination of protein-protein interactions by a combination of biosensor and mass spectrometric methods
Language: English
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja ; Lermyte, Prof. Dr. Frederik
Date: 21 March 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: ii, 203 Seiten
Date of oral examination: 5 February 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00026779

The focus of the present work is the characterization of binding sites (epitopes) of antibodies and aptamers against the four model proteins interleukin-8 (IL8, CXCL8), cathepsin D (CTSD), α-glucosidase A (GAA) and survival motor neuron protein (SMN). Common to all subprojects was the isolation of potential epitope peptides from enzymatic digestion of the respective protein using affinity chromatography with immobilized antibody or aptamer. This experimental setup is called epitope extraction,¹ and eluated fractions were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-tof MS)² to identify the epitope peptide sequence based on the peptide masses. For further validation of the identified peptides, their affinity to the antibodies was determined by surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis.³ Epitope extraction with Sepharose-bound antibody was also compared with a variant in which the antibody was immobilized directly on an SPR chip.⁴ Epitope characterization is essential for the understanding of antibody function and for the development of various bioassays. The model proteins are all associated with different diseases, either as target proteins in the treatment of diseases or as potential biomarkers. IL8⁵ is associated with chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA), SMN⁶ with muscular atrophy (SMA), and CTSD⁷ and GAA⁸ with various lysosomal storage diseases (LSD). The elucidation of the epitopes of antibodies relevant to these proteins can help us understand their biological functions. For example, the antibody against IL8 inhibits its receptor binding and corresponding functions but can also be used for its detection. Epitope peptides can also be used to quantify a protein that serves as a biomarker for a specific disease, such as the SMN protein, a biomarker for spinal muscular atrophy. In CTSD, the binding sites of an antibody should be compared with those of an aptamer, and the epitope peptides of GAA should help to remove antibodies, which are formed against the drug in enzyme replacement therapy (ERT) from blood of patients using apheresis. In the epitope extraction experiments for the complex of IL8 with the monoclonal antibody mAB-I2519, epitope peptides could be identified particularly well when the corresponding antibodies were bound to gold chips via protein G (PG). The investigation of IL8 and its peptides was complicated by their relatively strong binding to various surfaces, such as sepharose 4B. When peptides from a tryptic digest were used, a discontinuous epitope for mAB-I2519 consisting of IL8[12-20] and IL8[55-60] was obtained. The affinities of the antibody-antigen complex were determined by using the SPR-based biosensor. The immobilization of the antibody via protein G yielded stable and highly active surfaces. For the interaction of IL8 with mAB-I2519, a KD of 7.4 nM was determined; for the peptide IL8[12-20], a KD of 75.1 μM and for IL8[55-60] of 0.98 mM. Both peptides bind the antibody paratope with low affinity, which is why both must be presented in a specific conformation in order to bind the antibody with a correspondingly high affinity. IL8[12-20] is part of the receptor binding site, and IL8[55-60] is responsible for binding to glycans on cell surfaces, which is important for IL8 gradient formation required for leukocyte recruitment. Therefore, mAB-I2519 simultaneously inhibits the binding of IL8 to its receptor and cell surfaces, thus preventing its biological effect. The SMN protein and its monoclonal antibody mAB-7B10 were analyzed similarly to IL8 and its antibody mAB-I2519. For the complex of SMN and mAB-7B10, a known epitope on the recombinant SMN (rSMN) protein was extracted in the form of the tryptic peptide rSMN[37-57]. In this context, epitope extraction was also successfully performed using an SPR-based biosensor. The affinity of mAB-7B10 to rSMN is 0.25 - 0.69 nM; for the synthetic epitope peptide rSMN[37-57], it is 3.2 nM. Due to the well-preserved affinity of the epitope peptide, it was successfully used in a proof-of-concept for a diagnostic assay to quantify the SMN protein from biological samples by epitope extraction and MALDI-tof MS. Appropriate calibration curves in conjunction with a first successful extraction of the epitope peptide from whole blood lysate were obtained. In addition, polyclonal antibodies with an epitope in the C-terminal region of SMN were tested with mAB-7B10 in a sandwich SPR assay, which could be used as an alternative strategy to quantify the SMN protein. The signal amplification by the second antibody could increase the assay’s sensitivity. The examination of the CTSD-antibody and -aptamer complexes, respectively, and the GAA antibody complex did not lead to unambiguous identification of epitopes or binding sites. This was mainly due to the large amount of unspecific sepharose-binding peptides originating from the respective protein digestion with trypsin and chymotrypsin. Therefore, alternative methods would have to be used for epitope identification of these proteins. In order to recognize protein epitopes that are difficult to access via epitope extraction, at an early stage, specific scouting experiments for unspecific column-binding peptides from digestions with different proteases must be carried out in the future. This would allow the determination of the difficulty level of an epitope to be determined using the epitope extraction method. For the GAA antibody, it was known that the epitope should be located in the 70 kDa fragment of the protein complex, which is why at least the epitope could be narrowed down to a region around GAA[317-324], GAA[304-349], and GAA[411-458]. In addition to the experimental lab work, in-silico predictors for B-cell epitope prediction were used to evaluate the identified peptides a part of a potential epitope. The predictions of the software tools DiscoTope 2.0,⁹ Seppa 3.0,¹⁰ BepiPred 2.0,¹¹ and BCEPS¹² included the epitopes for SMN and IL8. For CTSD and GAA, many of the identified peptides were identified by the epitope predictors, but due to the large proportion of non-specific binders, no unique epitope peptide could be assigned. However, for the investigated proteins, the epitope predictions showed that other proteases, such as Glu-C, Lys-C, or Arg-C, would have been advantageous for the formation of epitope-forming peptides, as they do not cleave at potentially critical positions for antibody binding. Therefore, in-silico analysis can help to design and improve the experimental setup of a particular epitope identification. Finally, the enzymatic digestion of proteins under high-pressure was tested with the four model proteins, as the digestion is essential for epitope extraction. High-pressure digestion was carried out under repeated cycles of high and low pressure and is referred to as "pressure cycling technology" (PCT).¹³ The tests were performed with trypsin, and the peptides were analyzed by MS. Performance parameters such as sequence coverage, digestion speed, enzyme specificity, and peptide peak patterns were compared with a standard procedure under atmospheric pressure. The parameters showed similar values for digestion under atmospheric and high pressure. There is evidence that much lower amounts of the enzyme could be used for high-pressure digestion, with a few hours or less sufficient for complete specific digestion, but this will need further investigation. At last, these experiments confirmed that trypsin does not change its specificity and activity under high pressure.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildet die Charakterisierung der Bindestellen (Epitope) von Antikörpern bzw. Aptameren der vier Modellproteine Interleukin-8 (IL8, CXCL8), Cathepsin D (CTSD), α-Glucosidase A (GAA) und Survival Motor Neuron Protein (SMN). Allen Teilprojekte gemeinsam war die Isolierung von potenziellen Epitoppeptiden aus einem enzymatischen Verdau des jeweiligen Proteins durch die Affinitätschromatographie an immobilisiertem Antikörper bzw. Aptamer. Dieser Versuchsaufbau wird Epitopextraktion genannt.¹ Die einzelnen Fraktionen von der Affinitätssäule wurden mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisierungs-Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-tof MS)² untersucht, um anhand der Peptidmassen die Epitoppeptide und deren Sequenz zu bestimmen. Zur weiteren Validierung der identifizierten Peptide wurde deren Affinität zu den Antikörpern mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Biosensoranalyse untersucht.³ Dabei sollte auch die Epitopextraktion mit Sepharose gebundenem Antikörper mit einer Variante verglichen werden, bei der der Antikörper direkt auf einem SPR-Chip immobilisiert war.⁴ Die Epitopcharakteriserung ist beim Verständnis der Funktion von Antikörpern und bei der Entwicklung verschiedenster Bioassays von Bedeutung. Die Modellproteine stehen alle in Verbindung mit verschiedenen Krankheiten, sei es als Zielproteine bei der Behandlung von Krankheiten oder als potenzielle Biomarker. Dabei wird IL8⁵ mit chronisch entzündlichen Krankheiten, wie rheumatoider Arthritis (RA), SMN⁶ mit der Muskelatrophie (SMA), und CTSD⁷ und GAA⁸ mit verschiedenen lysosomalen Speicherkrankheiten in Verbindung gebracht. Die Aufklärung Epitope von Antikörpern an diese Proteine können dabei helfen, deren biologische Funktionen besser zu verstehen. Zum Beispiel inhibiert der Antikörper gegen IL8 dessen Rezeptorbindung und entsprechende Funktionen, kann aber auch zu dessen Nachweis eingesetzt werden. Epitoppeptide können aber auch zur Quantifizierung eines Proteins verwendet werde, das als Biomarker für eine bestimmte Krankheit dient, wie beim SMN-Protein, das ein Biomarker für die spinale Muskelatrophie ist. Bei CTSD wiederum sollten die Bindungsstellen eines Antikörpers mit denen eines Aptamers verglichen werden und die Epitoppeptide von GAA sollten bei der Enzymersatztherapie (ERT) mittels Apherese dabei helfen, Antikörper gegen das Medikament aus dem Blut zu entfernen. Bei den Epitopextraktionsexperimenten für den Komplex von IL8 mit dem monokonalen Antikörper mAB-I2519 konnten Epitoppeptide besonders gut identifiziert werden, wenn die entsprechenden Antikörper über Protein G an Goldchips gebunden waren. Die Untersuchung von IL8 und seinen Peptiden wurde durch deren relativ starke Bindung an die verschiedensten Oberflächen, wie an die Sepharose 4B, erschwert. Beim Einsatz von Peptiden aus einem tryptischen Verdau ergab sich ein diskontinuierliches Epitop für mAB-I2519, das aus IL8[12-20] und IL8[55-60] besteht. Die Affinitäten der Antikörper-Antigen Komplexe wurden mit dem SPR-basierten Biosensor bestimmt. Die Immobilisierung wurde ebenfalls über Protein G erreicht und ergab stabile und hochaktive Antikörperoberflächen. Für die Wechselwirkung von IL8 mit mAB-I2519 wurde eine KD von 7,4 nM ermittelt, für das Peptid IL8[12-20] eine KD von 75,1 μM und für IL8[55-60] von 0,98 mM. Beide Peptide binden den Antikörper im Paratop mit geringer Affinität, weswegen beide in einer bestimmten Konformation präsentiert werden müssen, um den Antikörper mit einer entsprechend hohen Affinität zu binden. IL8[12-20] ist Teil der Rezeptorbindungsstelle und IL8[55-60] ist für die Bindung an Glykane auf Zelloberflächen verantwortlich, was wichtig für die IL8-Gradientenbildung zur Rekrutierung von Leukozyten ist. Daher hemmt mAB-I2519 gleichzeitig die Bindung von IL8 an seinen Rezeptor und an Zelloberflächen und verhindert auf diese Weise dessen biologische Wirkung. Mit den gleichen Methoden, wie zur Analyse der Interaktion von IL8 mit mAB-I2519, wurden das SMN-Protein und sein monoklonaler Antikörper mAB-7B10 untersucht. Für den Komplex von SMN und mAB-7B10 wurde ein bekanntes Epitop auf den SMN-Protein in Form des tryptischen Peptids rSMN[37-57] extrahiert. Die Epitopextraktion konnte in diesem Zusammenhang auch erfolgreich von einem SPR-Biosensorchip durchgeführt werden. Die Affinität von mAB-7B10 zu rSMN beträgt 0,25 - 0,69 nM; für das synthetische Epitoppeptid rSMN[37-57] liegt sie bei 3,2 nM. Aufgrund der gut erhaltenen Affinität des Epitoppeptids wurde es erfolgreich in einem Konzeptbeweis für einen diagnostischen Assay eingesetzt, mit dem das SMN-Protein aus biologischen Proben durch Epitopextraktion und MALDI-tof MS quantifiziert werden kann. Geeignete Kalibrierungskurven in Verbindung mit einer ersten erfolgreichen Extraktion des Epitoppeptids aus einer Vollblut-Lysatprobe wurden erhalten. Zusätzlich wurden polyklonale Antikörper mit einem Epitop im C-terminalen Bereich von SMN zusammen mit mAB-7B10 in einen Sandwich-SPR-Assay getestet, der als alternative Strategie zur Quantifizierung des SMN-Proteins eingesetzt werden könnte. Die Signalverstärkung durch den zweiten Antikörper soll dabei zu einem noch sensitiveren Assay führen. Die Untersuchung der CTSD-Antikörper bzw. -Aptamer-Komplexe und des GAA-Antikörper-Komplexes führten zu keiner eindeutigen Identifizierung von Epitoppeptiden und Bindungsstellen. Dies war vor allem auf die große Menge an unspezifischen Sepharose-bindenden Peptiden, die aus dem jeweiligen Proteinverdau mit Trypsin und Chymotrypsin stammten, zurückzuführen. Zur erfolgreichen Epitopidentifizierung müssten daher alternative Methoden verwendet werden. Um in Zukunft Proteinepitope, die über die Epitopextraktion schwerzugänglich sind, frühzeitig zu erkennen, müssen spezifische Scouting-Experimente für unspezifische säulenbindende Peptide aus Proteinverdauen mit unterschiedlichen Proteasen durchgeführt werden. Dadruch könnte der Schwierigkeitsgrad eines zu bestimmenden Epitopes mit der Epitopextraktionsmethode eingeschätzt werden. Für den GAA-Antikörper war bekannt, dass das Epitope im 70 kDa Fragement des Proteinkomplexes liegen soll, weswegen hier das Epitop zumindest auf eine Region um GAA[317-324], GAA[304-349], und GAA[411-458] eingegrenzt werden konnte. Zusätzlich zu den experimentellen Laborarbeiten wurden in-silico Prädiktoren für die B-Zell-Epitop Vorhersage eingesetzt, um die identifizierten Peptide als Teil eines potenziellen Epitops zu bewerten. Die verwendeten Softwaretools, DiscoTope 2.0,⁹ Seppa 3.0,¹⁰ BepiPred 2.0¹¹ und BCEPS¹² und deren Vorhersagen über die Epitope, beinhalteten die identifizierten Epitope aus den Analysen mit SMN und IL8. Für CTSD und GAA wurden viele der identifizierten Peptide ebenfalls als potenzielle Epitope vorhergesagt, aber wegen des großen Anteils von unspezifischen Bindern konnten keine eindeutigen Epitoppeptide ausgemacht werden. Für die untersuchten Proteine zeigten die Epitopvorhersagen jedoch, dass andere Proteasen, wie Glu-C, Lys-C oder Arg-C, für die Bildung von epitopabbildenden Peptiden von Vorteil gewesen wären, die die potenziellen Epitope nicht an potenziell kritischen Positionen für die Antikörperbindung gespalten hätten. Daher kann die in silico Analyse zur Planung und Verbesserung des Versuchsaufbaus für eine bestimmte Epitopidentifizierung beitragen. Schließlich wurde der enzymatische Verdau von Proteinen unter hohem Druck mit den vier Modellproteinen getestet, da dieser Schritt essenziell für die Epitopextrkation ist. Der Hochdruckverdau wurde unter wiederholten Zyklen von hohem und niedrigem Druck durchgeführt und wird als „pressure cycling technology“ bezeichnet.¹³ Die Tests wurden mit Trypsin durchgeführt und die erhaltenen Peptide wurden mittels MS charakterisiert. Unter anderem wurden Parameter für die Sequenzabdeckung, Verdauungsgeschwindigkeit, Enzymspezifität und erhaltene Peptidpeakmuster mit einem Standardverfahren unter Atmosphärendruck verglichen. Die Parameter zeigten ähnliche Werte für den Verdau unter atmosphärischem und hohem Druck. Es gibt Anzeichen dafür, dass für den Hochdruckaufschluss wesentlich geringere Mengen des Enzyms verwendet werden könnten, wobei einige Stunden oder weniger für den vollständigen Verdau ausreichen. Dies muss weiter untersucht werden. Außerdem bestätigen diese Experimente, dass Trypsin seine Spezifität und Aktivität unter hohem Druck nicht verändert.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-267798
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 21 Mar 2024 13:07
Last Modified: 12 Apr 2024 10:25
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26779
PPN: 51691832X
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