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Modulation of the FKBP51 structure by protein engineering and isolation of conformation-locking antibodies and affibodies

Lerma Romero, Jorge Alberto (2024)
Modulation of the FKBP51 structure by protein engineering and isolation of conformation-locking antibodies and affibodies.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026563
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Modulation of the FKBP51 structure by protein engineering and isolation of conformation-locking antibodies and affibodies
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Harald ; Hausch, Prof. Felix
Date: 2 February 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 190 Seiten in verschiedenen Zählungen
Date of oral examination: 22 January 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00026563

Proteins are biomolecules with an intrinsic flexibility that enables them to carry out their functions by interacting with other proteins, substrates, cells, and many other molecules. The structural flexibility of a protein influences ligand-protein binding, and for some therapeutic targets, this feature can limit the access to its binding site. This presents a constraint for the development of novel molecules to inhibit or activate a target protein. The FK506 binding protein 51 (FKBP51) is a member of the immunophilin family, and it is linked to several psychiatric and stress-related disorders, among many other reported diseases. Various members of the FKBP family possess an FK1 domain with a highly conserved active site (or orthosteric site). This is not only specific for FKBPs, but it is common to find largely conserved orthosteric sites across protein families. Due to small differences in the amino acid sequence of FKBP51 compared to other members of its family, this protein exhibits higher flexibility than other FKBPs, which translates into a higher number of possible conformers. One of these reported conformers forms a transient binding pocket that can potentially accommodate FKBP51-selective ligands without interacting with other members of this pro-tein family. This doctoral thesis focuses on the development of research tools to shift the conformational ensemble of FKBP51 from the native low-energy state (closed conformation) to a conformer with a sta-bilized transient binding pocket that can bind conformation-specific ligands. The first part of this work focuses on a protein engineering and screening strategy that was used to successfully identify FKBP51 variants with a favored open conformation of a transient binding pocket. To that end, the amino acids of the FKBP51 FK1 domain were systematically modified by random and Site Saturation Mutagenesis (SSM) to spot FKBP51 muteins that change the distribution of the protein to an open conformation, favoring the binding of two reported conformation-specific ligands. Firstly, random mutagenesis was used to mutate the FK1 domain-encoding gene of FKBP51. With this genetic material, a Yeast Surface Display (YSD) library presenting a pool of mutagenesis variants was created and screened via high throughput Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). From this first library, a specific region of the protein that destabilizes the FKBP51 binding pocket was identified. Subsequently, an SSM of the identified region spanning glycine-64 to serine-69 was applied, and a second YSD library was created and screened via FACS. From this SSM library, key residues for the destabilization of the FKBP51 binding pocket were identified. Three muteins with enhanced affinity to conformation-specific ligands (G64S, F67E, and D68Y) were characterized by fluorescence polarization and crystallography, and demonstrated to facilitate a cryptic site formation which enables the binding of the open confor-mation ligands. In subsequent experiments, these three improved FKBP51 variants were used as a starting point to create libraries with multiple mutations to further optimize the affinity to open conformation ligands. Addi-tional SSM libraries based on combinatorial and iterative mutagenesis yielded over 20 FKBP51 variants with two or more mutations that improved ligand binding. Moreover, variants with a mutated position K121 confirmed the importance of this loop region which was not identified in the initial experiments. From all four different libraries, over 30 unique FKBP51 muteins with one or multiple exchanged amino acids were found. FKBP51 is one of the many proteins with a reported transient binding pocket. Cryptic sites in a protein represent a unique opportunity to design high-affinity ligands that bind selectively to the target protein without interacting with structurally similar proteins and consequently, avoid off-target effects. Our pro-tein engineering-based research used FKBP51 as a model to test the possibilities and potential benefits of protein engineering methods coupled with a cell display system such as yeast surface display (YSD) and FACS to identify variants with enhanced binding to open conformation ligands. These methods were described in detail and are transferable to other proteins that, similarly to FKBP51, exhibit a transient binding pocket. This step-wise methodology can be used to systematically modify a target protein to shift a population from a native state with a low-populated conformer with a cryptic site, to a population with an open conformation that permits the binding of selective ligands. The second part of this study focused on the use of chicken-derived single-chain variable fragments (scFvs) as conformation-locking molecules to stabilize the open conformation of FKBP51 and facilitate the screening of novel selective inhibitors. An allosteric effector, in this case an scFv, would be able to redistribute the protein conformational ensembles, optimally favoring a low-populated conformation found in the unbound state. Because of the large evolutionary distance between humans and avians, chickens have a stronger im-mune response to human proteins than conventional murine immunizations to develop antibodies. For this reason, a Gallus gallus specimen was immunized with the FK1 domain of FKBP51. From the splenic RNA of the immunized animal, a pool of scFvs was synthesized and used to create a YSD library. This library was then screened in different campaigns to obtain either high-affinity binders, conformation locking, or blocking scFvs. While no blocking scFvs were found, the conformation-locking screening campaign generated six differ-ent scFvs, and one of them showed potential allosteric effects on FKBP51 which influenced the binding of canonical and conformation-selective ligands. Multiple fluorescence polarization (FP) and biolayer interferometry (BLI) assays were able to demonstrate the effect of the isolated clone T32, as a conformation-locking scFv. The allosteric effects of T32 were orthogonally assessed by Hydrogen/Deu-terium exchange Mass Spectrometry (HDX-MS), which revealed the binding epitope on FKBP51 and a clear conformational change in the region of the binding pocket. Moreover, the same goal was pursued by transferring the search of high-affinity binders and allosteric effectors to the screening of affibody molecules. These small molecules are derived from the Z-domain of Staphylococcus aureus. An affibody consists of a 3-helical structure where selected amino acids on two of their helices are randomized to create a synthetic library that acts as an antibody-mimicking molecule able to deliver high-affinity binders for many target proteins. An Escherichia coli display library express-ing affibodies was screened with the FK1 domain of FKBP51. Six screening rounds by magnetic-activated cell sorting (MACS) and FACS yielded four affibodies which bind FKBP51 and one of them with potential effects on ligand intake. Either by the use of FKBP51 muteins or interactions with an scFv, methods for the stabilization of the transient binding pocket of FKBP51 represent an invaluable set of research tools to characterize the molecular dynamics of the binding pocket and provide an alternative to find new FKBP51 selective lig-ands on a fragment screening basis. Moreover, both scFvs and affibodies as FKBP51 binders have the potential to be conjugated to detection reagents and make them effective resources for the biochemical characterization of FKBP51 selectively. The results presented in this thesis yielded biomolecules with potential applications in the research and characterization of FKBP51 and the search for high affinity and selective ligands that bind to the cryptic pocket of FKBP51.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Proteine sind Biomoleküle mit einer inhärenten Flexibilität, die es ihnen ermöglicht, ihre Funktionen durch Interaktion mit anderen Proteinen, Substraten, Zellen und vielen anderen Molekülen zu erfüllen. Die strukturelle Flexibilität eines Proteins kann die Liganden-Protein-Bindung beeinflussen, und bei einigen therapeutischen Zielmolekülen kann dies den Zugang der Liganden zu ihrer Bindungsstelle einschränken. Dies stellt ein Hindernis für die Entwicklung neuer Moleküle zur Hemmung oder Aktivierung eines Zielproteins dar. Das FK506-bindende Protein 51 (FKBP51) gehört zur Immunophilin-Familie und wird mit verschiedenen psychiatrischen und stressbedingten Störungen sowie mit vielen anderen Krankheiten in Verbindung gebracht. Verschiedene Proteine der FKBP-Familie verfügen über eine FK1-Domäne mit einer hochkonservierten aktiven Stelle (oder orthosterischen Stelle). Dies ist nicht spezifisch für FKBPs, sondern es kommt recht häufig vor, dass man weitgehend konservierte orthosterische Stellen innerhalb einer Proteinfamilie findet. Aufgrund kleiner Unterschiede in der Aminosäuresequenz von FKBP51 weist dieses Protein eine höhere Flexibilität als andere FKBPs auf, was sich in einer größeren Anzahl möglicher Konformere niederschlägt. Eines dieser bekannten Konformere bildet eine transiente Bindungstasche, die möglicherweise selektive Liganden von FKBP51 aufnehmen kann, ohne mit anderen Mitgliedern dieser Proteinfamilie zu interagieren. Der Schwerpunkt dieser Doktorarbeit liegt in der Entwicklung von Forschungsinstrumenten, um das Konformationsensemble von FKBP51 vom nativen Niedrigenergiezustand (geschlossene Konformation) in ein Konformer mit einer stabilisierten transienten Bindungstasche zu überführen, die konformationsspezifische Liganden binden kann. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit einer Protein-Engineering- und Screening-Strategie, die zur erfolgreichen Identifizierung von FKBP51-Varianten mit einer bevorzugt offenen Konformation der transienten Bindungstasche. Zu diesem Zweck wurden die Aminosäuren der FKBP51 FK1-Domäne systematisch durch Zufalls- und Sättigungsmutagenese (SSM) verändert, um FKBP51-Muteine zu finden, die das koformationelle Gleichgewicht des Proteins in Richtung einer offenen Konformation ändern, wodurch die Bindung von konformationsspezifischen Liganden begünstigt wird. Zunächst wurde das Gen, das für die FK1-Domäne von FKBP51 kodiert, mittels Random Mutagenese mutiert. Mit diesem genetischen Material wurde eine Yeast Surface Display (YSD)-Bibliothek mit einem Pool von Mutagenese-Varianten erstellt und mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) mit hohem Durchsatz durchmustert. Aus dieser ersten Bibliothek wurde eine spezifische Region im Protein identifiziert, die die FKBP51-Bindungstasche destabilisiert. Anschließend wurde eine SSM der identifizierten Region, die sich von G64 bis S69 erstreckt, angewandt, und eine zweite YSD-Bibliothek erstellt, die ebenfalls mittels FACS gescreent wurde. Aus dieser SSM-Bibliothek wurden Schlüsselreste für die Destabilisierung der FKBP51-Bindungstasche identifiziert. Drei Muteine mit erhöhter Affinität zu konformationsspezifischen Liganden (G64S, F67E und D68Y) wurden charakterisiert und es wurde nachgewiesen, dass sie die Bildung einer kryptischen Stelle erleichtern, die die Bindung von Liganden in offener Konformation ermöglicht. In nachfolgenden Experimenten wurden diese drei verbesserten FKBP51-Varianten als Ausgangspunkt für die Erstellung von Bibliotheken mit weiteren Mutationen verwendet, um die Affinität zu Liganden mit offener Konformation weiter zu optimieren. Additive SSM-Bibliotheken, die auf kombinatorischer und iterativer Mutagenese basieren, ergaben über 20 FKBP51-Varianten mit zwei oder mehr Mutationen, die die Ligandenbindung verbesserten. Darüber hinaus bestätigten Varianten mit einer mutierten Position K121 die Bedeutung dieser Schleifenregion, die in den ersten Experimenten nicht identifiziert werden konnte. In allen vier verschiedenen Bibliotheken wurden über 30 einzigartige FKBP51-Muteine mit einer oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren gefunden. FKBP51 ist eines von vielen Proteinen mit einer kryptischen Bindungstasche. Kryptische Stellen in einem Protein bieten eine einzigartige Gelegenheit, Liganden mit hoher Affinität zu entwickeln, die selektiv an das Zielprotein binden, ohne mit strukturell ähnlichen Proteinen zu interagieren, und folglich Off-Target-Effekte zu vermeiden. Unsere auf Protein-Engineering basierende Forschung nutzte FKBP51 als Modell, um die Möglichkeiten und potenziellen Vorteile von Protein-Engineering-Methoden in Verbindung mit einem Zell-Display-System wie Yeast Surface Display (YSD) und FACS zu testen, um Varianten mit verstärkter Bindung an Liganden mit offener Konformation zu identifizieren. Diese Methoden sind auf andere Proteine übertragbar, die ähnlich wie FKBP51 eine transiente Bindungstasche aufweisen. Mit dieser schrittweisen Methodik kann ein Zielprotein systematisch modifiziert werden, um eine Population von einem nativen Zustand mit einem schwach besiedelten Konformer und einer kryptischen Stelle in eine Population mit einer offenen Konformation zu verschieben, die die Bindung selektiver Liganden ermöglicht. Der zweite Teil dieser Studie konzentrierte sich auf die Verwendung von aus Hühnern gewonnenen einkettigen variablen Fragmenten (scFvs) als konformationsverriegelnde Moleküle, um die offene Konformation von FKBP51 zu stabilisieren und das Screening neuartiger selektiver Hemmstoffe zu erleichtern. Ein allosterischer Effektor, in diesem Fall ein scFv, wäre in der Lage, das Konformationsensemble des Proteins umzuverteilen und dabei eine niedrig besiedelte Konformation im ungebundenen Zustand optimal zu begünstigen. Aufgrund des großen evolutionären Abstands zwischen Menschen und Vögeln haben Hühner eine stärkere Immunreaktion auf menschliche Proteine, als es bei der herkömmlichen Immunisierung von Mäusen zur Entwicklung von Antikörpern der Fall ist. Aus diesem Grund wurde ein Gallus gallus Exemplar mit der FK1-Domäne von FKBP51 immunisiert. Aus der Milz-RNA des immunisierten Tieres wurde ein Pool von scFvs synthetisiert und zur Erstellung einer YSD-Bibliothek verwendet. Diese Bibliothek wurde dann in verschiedenen Kampagnen gescreent, um entweder hochaffine Binder, konformationssperrende oder blockierende scFvs zu erhalten. Während keine blockierenden scFvs gefunden wurden, brachte die Conformation-Locking-Screening-Kampagne sechs verschiedene scFvs hervor, von denen einer (bezeichnet als Kandidat T32) potenzielle allosterische Effekte auf FKBP51 hatte, die die Bindung von kanonischen und konformationsselektiven Liganden beeinflussten. Mehrere Fluoreszenzpolarisations- (FP) und Biolayer-Interferometrie- (BLI) Experimente konnten die Wirkung von T32 als konformationsbindendes scFv nachweisen. Diese Wirkung von T32 wurde nachfolgend orthogonal durch Wasserstoff-/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) untersucht, welche das Bindungsepitop auf FKBP51 und eine deutliche Konformationsänderung im Bereich der Bindungstasche durch allosterische Effekte des T32 scFv aufzeigte. Darüber hinaus wurde das gleiche Ziel verfolgt, indem die Suche nach hochaffinen Bindern und allosterischen Effektoren auf das Screening von Affibody-Molekülen übertragen wurde. Diese kleinen Moleküle sind von der Z-Domäne von Staphylococcus aureus abgeleitet. Ein Affibody besteht aus einer 3-Helix-Struktur, bei der ausgewählte Aminosäuren auf zwei ihrer Helices randomisiert sind, um eine synthetische Bibliothek zu schaffen, die als Antikörper-ähnliches Molekül fungiert und hochaffine Binder für viele Zielproteine liefern kann. Eine Escherichia coli Display-Bibliothek, die Affibodies exprimiert, wurde mit der FK1-Domäne von FKBP51 gescreent. Sechs Screening-Runden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) und FACS ergaben vier Affibody, die FKBP51 binden, und einen davon mit potenzieller Wirkung auf die Ligandenaufnahme. Methoden zur Stabilisierung der transienten Bindungstasche von FKBP51, entweder durch die Verwendung von FKBP51-Muteinen oder durch Wechselwirkungen mit einem scFv, stellen ein unschätzbares Forschungsinstrumentarium zur Charakterisierung der molekularen Dynamik der Bindungstasche dar und bieten eine Alternative zur Suche nach neuen selektiven FKBP51-Liganden im Rahmen eines Fragmentscreenings. Darüber hinaus können sowohl scFvs als auch Affibodies als FKBP51-Binder an jedes beliebige Nachweisreagenz konjugiert werden, was sie zu effektiven Ressourcen für die biochemische Charakterisierung von FKBP51 macht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse haben Biomoleküle hervorgebracht, die bei der Erforschung und Charakterisierung von FKBP51 und bei der Suche nach hochaffinen und selektiven Liganden, die an die kryptische Tasche von FKBP51 binden, eingesetzt werden können.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-265635
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 02 Feb 2024 13:36
Last Modified: 05 Feb 2024 07:26
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26563
PPN: 515231657
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