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Refined generation of chimeric antigen receptor T cells by dasatinib and urolithin A

Braun, Angela (2024)
Refined generation of chimeric antigen receptor T cells by dasatinib and urolithin A.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026546
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Refined generation of chimeric antigen receptor T cells by dasatinib and urolithin A
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Buchholz, Prof. Dr. Christian
Date: 25 January 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 139 Seiten in verschiedenen Zählungen
Date of oral examination: 12 January 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00026546

In recent years, genetic modification of T lymphocytes has revolutionized the treatment of certain types of hematopoietic cancer. Equipping T lymphocytes with chimeric antigen receptors (CARs) directed towards tumor-associated antigens (TAAs) has shown great clinical success in tumor cell elimination. However, there are still limitations to CAR T cell therapy that hinder its broader application and clinical efficacy. These limitations include the laborious manufacturing process and the quality of the resulting CAR T cells in terms of their efficacy and persistence. During manufacturing, the transduction of T cells, most often using lentiviral vectors (LVs), comprises extensive isolation and activation of T cells to ensure safe and efficient gene delivery. To reduce the risk of unwanted transduction and allow transduction of non-activated T cells, T cell-targeted LVs have been developed. Among these, CD3-LV is of potential relevance since the CD3 receptor in complex with the T cell receptor (TCR) is exclusively expressed on T cells and CD3-LV has been shown to activate and transduce non-activated T cells. However, CD3-LV-induced T cell activation increases CD3:TCR complex downregulation, eventually dampening gene transfer rates and preventing its clinical application. Regarding the quality of the CAR T cell product, CAR T cell activity is often hampered by limited engraftment and persistence caused by differentiation and exhaustion of the CAR T cells. Therefore, CAR T cells with the favorable T stem cell memory (TSCM) phenotype, have shown to be superior over conventional CAR T cells, as they greatly expand in vivo and have prolonged antitumor response. So far, attempts to increase the frequency of CAR TSCM cells have been restricted to introducing additional steps to the manufacturing process, such as cell sorting, enrichment, and reprogramming.

To address the two limitations explained above, the small molecules dasatinib and urolithin A (UA) were used to help refine the generation of CAR T cells. Dasatinib is a tyrosine kinase inhibitor (TKI) known to inhibit phosphorylation by the T cell specific tyrosine kinase Lck and thereby preventing T cell activation. UA on the other hand, has been shown to induce mitophagy which is associated with immunomodulatory effects such as an enhanced antitumor efficacy.

Incubation of activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with dasatinib prior to transduction with CD3-LV(GFP) significantly increased transduction efficiency by 3- to 10-fold in a time- and dose-dependent manner. The maximal enhancing effect was achieved when 50 nM dasatinib was applied for five hours during transduction, resulting in over 60% transduced cells. The transduction enhancing effect of dasatinib, did not impair viability or cell proliferation and was further increased when combined with the transduction enhancer vectofusin-1 (VF-1). Importantly, dasatinib also increased the transduction of cytokine-only stimulated PBMCs and non activated PBMCs in whole blood. In an in vivo approach, treatment with dasatinib did not interfere with the selectivity of CD3-LV, and one mouse treated with dasatinib prior to CD3-LV administration showed a higher transduction level and vector genome integration compared to untreated mice. While dasatinib increased transduction efficiency of CD3 LV in all these setups, it had no effect on transduction using CD4-, CD8- or VSV LV. The inhibition of endocytosis or other tyrosine kinases did not enhance transduction by CD3-LV. Instead, preventing CD3-LV-induced T cell activation with dasatinib increased CD3 receptor availability and improved CD3-LV binding to the cells, most likely being the cause for dasatinib’s enhancing effect. When CD19.CAR was delivered instead of the gfp reporter gene, dasatinib had the same effect on enhancing CD3-LV transduction. The presence of dasatinib during transduction with CD3-LV resulted in CAR T cell levels similar to those achieved with VSV-LV. These CAR T cells were able to efficiently kill tumor cells while expressing lower levels of exhaustion markers and exhibiting a slightly more naïve phenotype. While tumor cell killing was not affected by dasatinib, the secretion of pro-inflammatory cytokines during killing was reduced for CAR T cells generated in presence of dasatinib, regardless of whether they were transduced with CD3- or VSV-LV. Thus, dasatinib not only reduced CD3-LV-induced stimulation, resulting in increased CD3 LV-mediated gene transfer, but also reduced transduction-induced stimulation by LVs in general. The second part of this thesis focused on the effect of UA on T cells and the generation of CAR T cells. Cultivation of T cells directly after transduction with LVs in medium containing 25 µM UA resulted in a 10-fold expansion of TSCM cells which among CAR-expressing T cells resulted in 50% TSCM cells. This shift in phenotype is most likely attributed to the induction of mitophagy. Cultivation in UA containing medium had no effect on the transduction efficiency or CAR expression. The high proportion of CAR TSCM cells did not impair killing efficacy of neither CD19.CAR nor CEA.CAR T cells. Accordingly, the transduction enhancing effect of dasatinib with CD3-LV was combined with the expansion of CEA.CAR TSCM cells by UA, which allowed the selective transduction of 40% of the T cells, of which 30% showed to have the TSCM phenotype, resulting in a high proportion of functional CAR TSCM cells.

This work represents the first description of dasatinib as transduction enhancer for CD3-LV thus identifying a new class of transduction enhancers. Dasatinib is a member of a here firstly described class of transduction enhancers that do not act by facilitating vector-cell interaction outside the cell, but instead increase the availability of the target receptor through intracellular mechanisms, in this case Lck inhibition. Thereby, dasatinib prevents CD3:TCR downregulation, increases the binding of CD3 LV to the cell and by fusion of more CD3-LV particles with the cell, helps evade possible intrinsic restriction factors (RFs). In addition, a simple protocol for the expansion of CAR TSCM cells was developed in this work. The cultivation of cells in UA containing medium significantly increases the amount of CAR TSCM cells and provides a simplified method to enrich TSCM cells compared to methods described so far. This demonstrates the ability of UA to reprogram human T cells towards the TSCM phenotype by inducing mitophagy, thereby enhancing T cell fitness and providing a valuable source for future tumor therapies. Taken together, the results obtained in this work demonstrate the potency of small molecules to further refine CAR T cell generation by representing a viable approach to facilitate gene delivery and generate a favorable CAR T cell phenotype, helping to improve therapeutic outcomes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In den letzten Jahren hat die Immuntherapie die Behandlung bestimmter Blutkrebsarten revolutioniert. Durch die Ausstattung von T-Lymphozyten mit chimären Antigenrezeptoren (CAR), die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, wurden große klinische Erfolge bei der Eliminierung von Tumorzellen erzielt. Die CAR T Zelltherapie stößt jedoch weiterhin auf Hindernisse, die einer breiteren Anwendung und höheren klinischen Wirksamkeit im Wege stehen. Dazu gehören primär der hohe Aufwand bei der Herstellung sowie die Qualität der resultierenden CAR-T-Zellen in Bezug auf Wirksamkeit und in vivo-Persistenz. Die genetische Modifikation von T-Zellen erfolgt in der Regel durch Transduktion mit lentiviralem Vektor (LV). Im Herstellungsprozess gehen der Transduktion umfangreiche Isolierungs- und Aktivierungsschritte voraus, um einen sicheren und effizienten Gentransfer in ausschließlich T-Zellen zu gewährleisten. Die Verwendung von T Zell spezifischen LV könnte diese Schritte umgehen, das Risiko einer unerwünschten Transduktion verringern und die Transduktion nicht-aktivierter T Zellen ermöglichen. Der CD3 Rezeptor targetierte LV (CD3-LV) ist hier von potentieller Bedeutung, da der CD3-Rezeptor im Komplex mit dem T-Zell-Rezeptor (engl. T cell receptor, TCR) ausschließlich auf T-Zellen exprimiert wird und CD3-LV nachweislich nicht-aktivierte T-Zellen aktiviert und transduziert. Die CD3-LV-induzierte T Zellaktivierung führt jedoch zu einer verstärkten Runterregulierung des CD3:TCR Komplexes, was letztlich die Gentransferraten dämpft und somit die klinische Anwendung verhindert. Im Hinblick auf die Qualität des CAR-T-Zellprodukts wird die CAR-T-Zellaktivität häufig durch eine begrenzte Expansion und Persistenz der Zellen im Patienten beeinträchtigt, die durch die Differenzierung und frühe Erschöpfung der CAR-T-Zellen verursacht wird. So haben sich CAR-T-Zellen mit dem T Gedächtnis Stammzell Phänotyp (engl. T stem cell memory, TSCM) gegenüber konventionellen CAR-T-Zellen als überlegen erwiesen, da sie eine starke Proliferation und eine verlängerte Antitumorantwort im Patienten zeigen. Bisherige Versuche die Häufigkeit von CAR TSCM-Zellen zu erhöhen, beschränkten sich auf die Einführung zusätzlicher Schritte im Herstellungsprozess. Um die genannten Hindernisse der CAR T Zelltherapie zu überwinden, wurden in dieser Arbeit die Moleküle Dasatinib und Urolithin A (UA) auf ihre Anwendbarkeit im Zusammenhang mit CAR-T-Zellen und deren Herstellung getestet. Dasatinib ist ein Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), der die Phosphorylierung durch die T-Zell-spezifischen Tyrosinkinase Lck hemmt und somit die Aktivierung der T-Zellen verhindert. Im Gegensatz dazu induziert UA nachweislich Mitophagie, was mit positiven immunmodulatorischen Effekten wie einer verbesserten Antitumorwirkung assoziiert ist.

Die Inkubation von peripheren mononuklearen Blutzellen (engl. peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) mit Dasatinib vor der Transduktion mit CD3-LV(GFP) steigerte die Transduktionseffizienz um das 3- bis 10-fache. Der Effekt war zeit- und konzentrationsabhängig und zeigte eine maximale Verstärkung nach fünfstündiger Inkubation der Zellen mit 50 nM Dasatinib, resultierend in über 60% transduzierter T Zellen. Die transduktionsverstärkende Wirkung von Dasatinib beeinträchtigte weder die Zellviabilität noch die Zellproliferation und wurde durch die Kombination mit dem Transduktionsverstärker Vectofusin-1 (VF 1) noch verstärkt. Dasatinib steigerte zudem die Transduktion von Zytokin stimulierten PBMCs und nicht-aktivierten PBMCs in Vollblut. Im Mausmodell zeigte sich, dass die Behandlung mit Dasatinib die Selektivität von CD3-LV nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus zeigte eine Maus, die vor der Verabreichung von CD3 LV mit Dasatinib behandelt wurde, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen eine leicht erhöhte Transduktionsrate und Integration des Vektorgenoms. Während Dasatinib die Transduktionseffizienz von CD3-LV in den verschiedenen Experimenten erhöhte, hatte es keine Auswirkungen auf die Transduktion mit CD4-, CD8- oder VSV LV. Die Hemmung der Endozytose oder anderer Tyrosinkinasen verstärkte die Transduktion durch CD3-LV nicht. Stattdessen erhöhte die Inhibierung der CD3 LV induzierten T-Zellaktivierung mit Dasatinib die Oberflächenexpression des CD3 Rezeptors und verbesserte die Bindung von CD3-LV an die Zellen. Dies ist höchstwahrscheinlich die Ursache für die transduktionsverstärkende Wirkung von Dasatinib. Die Generierung von CAR-T-Zellen durch Transduktion mit CD3-LV in Gegenwart von Dasatinib führte zu hohen CAR T Zellzahlen, vergleichbar mit denen die mit herkömmlichen LV erzielt werden. Diese CAR-T-Zellen waren in der Lage, Tumorzellen effizient zu eliminieren, während sie weniger Erschöpfungsmarker exprimierten und einen geringfügig naiveren Phänotyp aufwiesen. Während die zytotoxische Aktivität der CAR-T-Zellen gegen die Tumorzellen nicht beeinträchtigt wurde, war die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen bei CAR-T-Zellen, die in Gegenwart von Dasatinib generiert wurden, reduziert. Dies war unabhängig davon, ob die CAR T Zellen mit CD3- oder VSV-LV transduziert wurden. Dasatinib reduzierte also nicht nur die durch CD3-LV-induzierte Stimulation, sondern auch die durch LV Transduktion induzierte Stimulation im Allgemeinen. Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Wirkung von UA auf T-Zellen und die Generierung von CAR-T-Zellen untersucht. Hierfür, wurden T-Zellen kurz nach der Transduktion mit LV in Medium mit 25 µM UA über mehrere Tage kultiviert. Die Kultivierung der Zellen in UA-haltigem Medium führte zu einer 10-fachen Expansion der TSCM-Zellen, was bei CAR-exprimieren den T-Zellen zu 50% TSCM-Zellen führte. Diese Veränderung des Phänotyps ist höchstwahrscheinlich auf die Induktion der Mitophagie zurückzuführen ist. Die Kultivierung der Zellen in UA-haltigem Medium hatte keinen Einfluss auf die Transduktionseffizienz oder CAR Expression. Der hohe Anteil an CAR-TSCM-Zellen beeinflusste weder die zytotoxische Aktivität von CD19.CAR- noch von CEA.CAR-T-Zellen. Anschließend wurde der transduktionsverstärkende Effekt von Dasatinib mit CD3-LV und der Expansion der CEA.CAR TSCM-Zellen durch UA kombiniert. Die Kombination beider Behandlungen ermöglichte die selektive Transduktion von 40% der T-Zellen, von denen 30% den TSCM-Phänotyp aufwiesen, und führte dadurch zur Generierung zytotoxischer CAR TSCM-Zellen.

Diese Arbeit beschreibt erstmals die Funktion von Dasatinib als Transduktionsverstärker für CD3-LV und identifiziert eine neue Klasse von Transduktionsverstärkern. Dasatinib gehört zu einer hier erstmals beschriebenen Klasse von Transduktionsverstärkern, die nicht durch Erleichterung der Vektor Zell Interaktion außerhalb der Zelle wirken, sondern die Verfügbarkeit des Zielrezeptors durch intrazelluläre Mechanismen, in diesem Fall Lck-Inhibition, erhöhen. Auf diese Weise verhindert Dasatinib die Runterregulierung des CD3:TCR Rezeptorkomplexes, erhöht die Bindung von CD3-LV an die Zelle und hilft durch die Fusion von mehr CD3 LV-Partikeln mit der Zelle, mögliche intrinsische Restriktionsfaktoren (RFs) zu umgehen. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit ein einfaches Protokoll für die Expansion von CAR-TSCM-Zellen entwickelt. Die Kultivierung von Zellen in UA-haltigem Medium erhöht die Menge der CAR-TSCM-Zellen signifikant und bietet eine vereinfachte Methode zur Anreicherung von TSCM-Zellen im Vergleich zu bestehenden Methoden. Dies zeigt, dass UA in der Lage ist, menschliche T-Zellen durch Induktion von Mitophagie in Richtung des TSCM-Phänotyps umzuprogrammieren, wodurch die Fitness der T-Zellen verbessert und eine wertvolle Quelle für zukünftige Tumortherapien geschaffen wird.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-265465
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 25 Jan 2024 13:09
Last Modified: 26 Jan 2024 10:56
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26546
PPN: 515017833
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