TU Darmstadt / ULB / TUprints

Study of E. coli metabolic pathways for efficient production of commodity chemicals using synthetic biology and genome engineering

Goyal, Garima (2022):
Study of E. coli metabolic pathways for efficient production of commodity chemicals using synthetic biology and genome engineering. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020366,
[Ph.D. Thesis]

[img] Text
DoctoralThesis_GarimaGoyal_ver1.6.pdf
Available under: CC-BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution ShareAlike.

Download (4MB)
Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Study of E. coli metabolic pathways for efficient production of commodity chemicals using synthetic biology and genome engineering
Language: English
Abstract:

Although bio-based fuels and chemicals offer an appealing and more sustainable alternative to traditional petroleum-based fuels and chemicals, their widespread acceptance has been partially obstructed by their limited industry-level titer and yield improvements. Historically, E. coli developed for chemical production has been modified with intuition-based biochemical changes of genes and their expression at the plasmid level on a trial-and-error basis. This type of work can be high cost and labor-intensive, and very unstable for industrial applications. Here, we present our work on the employment of advanced synthetic biology and gene editing tools that can accelerate the understanding and engineering of the microbial metabolic pathways directed towards the systematic and stable improvement of process, yields, and rates for biofuels and bio-products production.

The overall objective of the current study is focused on studying and optimizing E. coli metabolic pathways for the efficient production of target bio-based compounds. We performed engineering of two E. coli metabolic pathways for optimizing the titers of two target compounds through a shared systematic approach of utilizing gene editing, strain development and optimization, and synthetic biology tools. Chapter three of this thesis involves the parallel integration and chromosomal expansion of the isoprenoid pathway in the E. coli genome for improved isopentenol titers. In this study, we enabled integration and independent expansions of three pathway components across multiple loci. Suicide vectors were used to achieve high-efficiency site-specific integration of sequence-validated multigene components and a heat-curable plasmid was introduced to obviate recA deletion post pathway expansion. Through 3-dimensional expansion, we generated libraries of pathway component copy number variants to screen for improved titers. Machine learning studies were conducted to predict the gene expression for the isopentenol titers. Polynomial regressor statistical modeling of the production screening data suggested that increasing copy numbers of all isopentenol pathway components would further improve titers. From the library of engineered strains with isoprenoid pathway components integrated and expanded in the genome, the best strain produced 344 mg/mL of isopentenol in the absence of selection pressure.

Chapter four focuses on the metabolic engineering of fatty acid biosynthesis pathway for efficient production of fatty alcohols in E. coli. Due to tight regulation of endogenous fatty acid biosynthesis pathway, growth essential pathway genes were removed from the genome via CRISPR-Cas9 and placed on the replicable and repressible bacterial artificial chromosome (BAC). Another BAC module that consisted of a heterologous pathway for fatty alcohols production was introduced. Both these modules in the defragged genome were confirmed to be orthogonal and independent of each other. BAC-A module was introduced to support the cell growth in the absence of native genes and BAC-B module's main function was to express heterologous pathway genes for producing high titers of fatty alcohols. CRISPR-Cas9 was developed for simultaneous and consequential multigene deletions of twenty-seven growth essential native pathway genes. A resulting engineered strain with defragged genome harboring BAC-A and BAC-B was tested for fatty alcohols under different express/repress conditions and performed 2.5 times better than an engineered non-FABIO strain (consists of BAC-B without repressing the growth essential genes).

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Obwohl biobasierte Kraftstoffe und Chemikalien eine attraktive und nachhaltigere Alternative zu den traditionellen erdölbasierten Kraftstoffen und Chemikalien darstellen, ist die Herstellung in industriellem Maßstab bis heute schwierig. Historisch gesehen wird E. coli für die Produktion genutzt, und biochemischen Veränderungen von Genen und deren Expression auf Plasmid-Ebene wurden meist auf Intuition basierend auf einer Trial-and-Error-Basis durchgeführt. Dieser Ansatz kann sehr kosten- und arbeitsintensiv sein, und ist für industrielle Anwendungen daher nur mäßig geeignet. Hier stellen wir unsere Arbeit zum Einsatz fortschrittlicher Werkzeuge der synthetischen Biologie und des Gene Editing vor, die das Verständnis und das Engineering der mikrobiellen Stoffwechselwege beschleunigen können, und somit systematisch und robuste Verbesserungen der Produktion von Biokraftstoffen und Bioprodukten ermöglichen.

Das Gesamtziel der Arbeit ist die Untersuchung und Optimierung von E. coli Stoffwechselwegen für die effiziente Produktion von biobasierten Chemikalien. Zwei E. coli-Stoffwechselwege wurden untersucht, und die Titer von zwei Zielverbindungen wurden mit Hilfe von Gene Editing, Stammentwicklung und Werkzeugen der synthetischen Biologie optimiert. Kapitel drei dieser Arbeit umfasst die parallele Integration und chromosomale Erweiterung des Isoprenoid-Stoffwechselwegs in das E. coli-Genom zur Verbesserung des Isopentenol-Titers. In dieser Studie nutzten wir die Integration und unabhängige Expansion von drei Stoffwechselwegkomponenten in mehreren Loci. Suizid-Vektoren wurden verwendet, um eine hocheffiziente ortsspezifische Integration von sequenzvalidierten Multigen-Komponenten zu erreichen, und ein hitzemodifizierbares Plasmid wurde eingeführt, um die recA-Deletion nach der Pathway-Expansion zu vermeiden. Durch 3-dimensionale Expansion generierten wir Bibliotheken von Pathway-Komponenten mit unterschiedlichen Kopienzahlen, um verbesserte Titer zu erreichen. Maschinelles Lernen wurden genutzt, um die Genexpression für die Isopentenol-Titer vorherzusagen. Die statistische Modellierung der Produktions-Screening-Daten mit einem polynomialen Regressor legte nahe, dass eine Erhöhung der Kopienzahl aller Isopentenol-Stoffwechselweg-Komponenten die Titer weiter verbessern würde. Aus der Bibliothek der manipulierten Stämme mit genomisch integrierten und erweiterten Isoprenoid-Stoffwechselweg-Komponenten produzierte der beste Stamm 344 mg/mL Isopentenol wenn kein Selektionsdruck vorlag.

Kapitel vier konzentriert sich auf das Metabolic Engineering des Fettsäurebiosynthesewegs zur effizienten Produktion von Fettalkoholen in E. coli. Aufgrund der engen Regulation des endogenen Fettsäurebiosynthesewegs wurden die wachstumsrelevanten Gene mittels CRISPR-Cas9 aus dem Genom entfernt und auf einem replizierbaren und repressiblen bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) platziert. Ein weiteres BAC-Modul, bestehend aus einem heterologen Stoffwechselweg für die Produktion von Fettalkoholen, wurde eingeführt. Es wurde bestätigt, dass sich diese beiden Module im defragmentierten Genom orthogonal und unabhängig voneinander verhalten. Das BAC-A-Modul wurde eingeführt, um das Zellwachstum in Abwesenheit von nativen Genen zu unterstützen, die Hauptfunktion des BAC-B-Moduls war die Expression von Genen des heterologen Stoffwechselweges zur Produktion hoher Titer von Fettalkoholen. CRISPR-Cas9 wurde für die gleichzeitige Multigen-Deletion von siebenundzwanzig wachstumsrelevanten nativen Stoffwechselwegen entwickelt. Ein daraus resultierender Stamm mit defragmentiertem Genom, der BAC-A und BAC-B beherbergt, wurde unter verschiedenen Expressions- und Repressionsbedingungen auf Fettalkohole getestet und schnitt 2,5-mal besser ab als ein manipulierter nicht-FABIO-Stamm (der aus BAC-B besteht, ohne die wachstumsrelevanten Gene zu unterdrücken).

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 164 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Computer-aided Synthetic Biology
Date Deposited: 07 Feb 2022 12:11
Last Modified: 07 Feb 2022 12:12
DOI: 10.26083/tuprints-00020366
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-203661
Referees: Kabisch, Prof. Dr. Johannes ; Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Date of oral examination: 12 November 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20366
PPN:
Export:
Actions (login required)
View Item View Item