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Structure and function analysis of two channel forming membrane proteins of medical importance – The lysosomal Transmembrane Protein 175 and the Envelope Protein of SARS-CoV-2

Schulze, Tobias (2022):
Structure and function analysis of two channel forming membrane proteins of medical importance – The lysosomal Transmembrane Protein 175 and the Envelope Protein of SARS-CoV-2. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00019792,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Structure and function analysis of two channel forming membrane proteins of medical importance – The lysosomal Transmembrane Protein 175 and the Envelope Protein of SARS-CoV-2
Language: English
Abstract:

In this work, two channel proteins of medical importance were electrophysiologically investigated and characterized. In the first part of this work, the lysosomal TMEM175 channel was in the focus of the studies. TMEM175 is associated with the development of Parkinson’s disease (PD) through a yet unknown mechanism, underscoring the importance of this channel to regulation of cellular homeostasis. The family of TMEM175 proteins in general constitutes a recently discovered type of K+ channels that are important for autophagosome turnover and lysosomal pH regulation. From a structural point of view, TMEM175 channels lack the typical P-loop type selectivity filter, a hallmark of all canonical K+ channels. This raises the question on how K+ selectivity is achieved in TMEM175 channels. In this study, new insights gained by the X-ray structure of a closed bacterial TMEM175 channel are used in combination with electrophysiological methods to address this very question. By performing mutational studies and subsequent electrophysiological investigations, Thr38 of MtTMEM175 as well as the corresponding layer of threonines in the human homolog (hTMEM175) were found to play a pivotal role in K+ selectivity. The data suggests this mechanism to be a general explanation for K+ selectivity in TMEM175 channels. An additional layer in the hTMEM175 comprising two serines further increases selectivity and renders this channel sensitive to blockers like 4-aminopyridine and Zn2+. The combination of structural data, mutations and electrophysiological measurements indicate that large hydrophobic side chains occlude the pore, forming a physical gate in TMEM175 channels. Channel opening of MtTMEM175 by an iris-like motion simultaneously relocates the gate and exposes the otherwise concealed selectivity filter to the pore lumen. Close scrutiny of closed- and open-state hTMEM175 cryo-EM structures furthermore provides a coherent hypothesis on a gating mechanism based on charged residues at the extracellular pore entrance. In the second part of this work, the envelope protein of SARS-CoV-2 and its effects on the homeostasis of the host cell of the virus were studied. SARS-CoV-2 produces in host cells large amounts of envelope proteins (Ep-CoV-2). To mimic its pathophysiological impact, Ep-CoV-2 was expressed in mammalian cells and the effects on signaling parameters monitored. We detected fluorescent tagged Ep-CoV-2 in the endoplasmic reticulum and trace amounts in the plasma membrane. Wild-type (wt) Ep-CoV-2 and, to a lesser extent, its mutants (N15A, V25F) and the isolated transmembrane domains corrupted major signaling cascades in cells causing elevated intracellular Ca2+ as well as pH and membrane depolarization. These Ep-CoV-2-triggered effects, which potentially contribute to the pathogenesis of the viral protein, seem to result from an ion-channel activity. Two independent assays, functional reconstitution of Ep-CoV-2 in artificial membranes and rescue of K+-deficient yeast mutants, confirm that Ep-CoV-2 generates a cation-conducting channel with a low unitary conductance and a complex ion selectivity. All results together suggest that inhibitors of this channel function can provide cell protection and virostatic effects.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In dieser Arbeit wurden zwei Kanalproteine von medizinischer Bedeutung elektrophysiologisch untersucht und charakterisiert. Im ersten Teil dieser Arbeit stand der lysosomale Kanal TMEM175 im Mittelpunkt der Untersuchungen. TMEM175 steht über einen noch unbekannten Mechanismus mit der Entstehung der Parkinson-Krankheit in Verbindung, was die Bedeutung dieses Kanals für die Regulierung der zellulären Homöostase unterstreicht. Die Familie der TMEM175-Proteine stellt im Allgemeinen einen kürzlich entdeckten Typ von K+-Kanälen dar, die für den Umsatz von Autophagosomen und die lysosomale pH-Regulierung wichtig sind. Strukturell gesehen fehlt den TMEM175-Kanälen der typische P-loop Selektivitätsfilter, ein Markenzeichen aller kanonischen K+-Kanäle. Dies wirft die Frage auf, wie die K+-Selektivität in TMEM175-Kanälen erzeugt wird. In dieser Studie werden neue Erkenntnisse aus der Röntgenstruktur eines geschlossenen bakteriellen TMEM175-Kanals in Kombination mit elektrophysiologischen Methoden genutzt, um genau diese Frage zu beantworten. Durch Mutationsstudien und anschließende elektrophysiologische Untersuchungen wurde festgestellt, dass Thr38 von MtTMEM175 sowie die entsprechende Schicht von Threoninen im menschlichen Homolog (hTMEM175) eine zentrale Rolle bei der K+-Selektivität spielen. Die Daten legen nahe, dass dieser Mechanismus eine allgemeine Erklärung für die K+-Selektivität in TMEM175-Kanälen darstellt. Eine zusätzliche Schicht im hTMEM175, die zwei Serine umfasst, erhöht die Selektivität weiter und macht diesen Kanal empfindlich gegenüber Blockern wie 4-Aminopyridin (4-AP) und Zn2+. Die Kombination von Strukturdaten, Mutationen und elektrophysiologischen Messungen deutet darauf hin, dass große hydrophobe Seitenketten die Pore von TMEM175-Kanälen verschließen und ein physikalisches Tor bilden. Die Kanalöffnung von MtTMEM175 durch eine irisähnliche Bewegung verlagert gleichzeitig das Tor und legt den sonst verborgenen Selektivitätsfilter zum Porenlumen frei. Die genaue Untersuchung der Kryo-EM-Strukturen von hTMEM175 im geschlossenen und offenen Zustand liefert darüber hinaus eine kohärente Hypothese für einen Gating-Mechanismus, der auf geladenen Resten am extrazellulären Poreneingang beruht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Hüllprotein von SARS-CoV-2 und seine Auswirkungen auf die Homöostase der Wirtszelle des Virus untersucht. SARS-CoV-2 produziert in den Wirtszellen große Mengen an Hüllproteinen (Ep-CoV-2). Um seine pathophysiologischen Auswirkungen zu imitieren, wurde Ep-CoV-2 in Säugetierzellen exprimiert und die Auswirkungen auf Signalparameter beobachtet. Wir wiesen Fluoreszenz-markiertes Ep-CoV-2 im ER und kleinere Mengen in der Plasmamembran nach. Der Wildtyp Ep-CoV-2 und in geringerem Maße seine Mutanten (N15A, V25F) sowie dessen isolierte Transmembrandomäne beeinträchtigten wichtige Signalkaskaden in den Zellen und verursachten einen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Levels sowie des pH-Werts und eine Depolarisierung der Membran. Diese durch Ep-CoV-2 ausgelösten Effekte, die möglicherweise zur Pathogenese des viralen Proteins beitragen, scheinen auf eine Ionenkanalaktivität zurückzuführen zu sein. Zwei unabhängige Tests, die funktionelle Rekonstitution von Ep-CoV-2 in künstlichen Membranen und die Komplementation von K+-defizienten Hefemutanten, bestätigen, dass Ep-CoV-2 einen kationenleitenden Kanal mit einer niedrigen Leitfähigkeit und einer komplexen Ionenselektivität erzeugt. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass Inhibitoren dieser Kanalfunktion Zellschutz- und virostatische Effekte erzeugen könnten.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: iv, 98, iv Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 10 Feb 2022 13:41
Last Modified: 10 Feb 2022 13:41
DOI: 10.26083/tuprints-00019792
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-197927
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Laube, Prof. Dr. Bodo ; Stein, Prof. Dr. Viktor ; Meckel, PD Dr. Tobias
Date of oral examination: 16 December 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19792
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