Hefen gehören zur Abteilung der Ascomycota und werden seit Jahrzehnten als zelluläre Plattformen für verschiedene biotechnologische Anwendungen genutzt. Sie sind einzellige eukaryotische Mikroorganismen, die schnell und robust wachsen und eine unkomplizierte Handhabung und Produktion vieler funktioneller eukaryotischer Proteine ermöglichen. Die Kombination von einfacher genetischer Manipulation mit direkten funktionellen Screening-Assays ermöglicht darüber hinaus vielseitige Anwendungen von Hefe im Metabolic- und Protein Engineering. Die Kombination von Selektions- und Screening-Assays mit zufällig mutierten Protein Bibliotheken bietet darüber hinaus die Möglichkeit, die Funktion von gewünschten Proteinen zu verändern und zu untersuchen.

Diese Dissertation beschreibt in fünf Kapiteln Anwendungen des Metabolic Engineering in S. cerevisiae mit dem Ziel, diese Hefezellen für biotechnologische Anwendungen zu manipulieren und anzupassen.

Kapitel I beschreibt die Entwicklung eines Retinal synthetisierenden Hefestamms, der eine Defizienz in den K+-Aufnahmesystemen aufweist (trk1Δ/trk2Δ). Dieser Stamm soll als einfache zelluläre Plattform für die funktionelle Expression von Rhodopsin-basierten Kanalproteinen verwendet werden. Wachstumsversuche mit diesem Stamm sind möglich, da diese Hefen aufgrund einer Deletion der wichtigsten Kaliumaufnahmesysteme (Trkp1p und Trk2p) nicht in kaliumarmen Standardmedien wachsen können. Die Daten zeigen, dass ein vollständiger Stoffwechselweg für die Retinal-Synthese erfolgreich in diesen Hefestamm integriert werden kann. Wachstumsversuche in flüssigem Medium zeigen die Funktionalität einer Channelrhodopsin-2-Variante, einem Kationenkanal, der Retinal für seine Funktionalität benötigt. In kaliumarmem Standardmedium wird ein Hefewachstum in Abhängigkeit von blauem Licht beobachtet. Dies zeigt, dass die Zellen eine blaulicht-abhängige K+-Leitfähigkeit exprimieren. Ergänzende Experimente zeigen auch eine blaulicht-abhängige Wachstumshemmung in einem Medium mit hohen NaCl-Konzentrationen. Dies deutet darauf hin, dass die durch Blaulicht aktivierte Channelrhodopsin-2-Variante einen Na+-Einstrom ermöglicht, der zu einer hohen intrazellulären Na+-Akkumulation und schließlich zur Wachstumshemmung führt.

In Kapitel II wird ein System beschrieben, bei dem ein trk1Δ/trk2Δ-Hefestamm als Plattform für die Untersuchung einer durch Blaulicht aktivierten Expression heterologer Proteine verwendet wird. Zu diesem Zweck wurde ein CRY2-CIB1-basiertes Transkriptionssystem verwendet, um die Expression des kleinen viralen Kaliumkanals KcvPBCV-1 durch Blaulicht zu induzieren. Dieses System ist in der Lage, eine durch Licht induzierte K+-Aufnahme zu erzeugen, was zu einer Wiederherstellung des Wachstums dieses Hefestamms in kaliumarmem Medium führt. In Kombination mit einem mikrofluidischen System war es möglich, die Expressionskinetik des Kanals nach Blaulichtstimulation zu verfolgen. Diese kinetische Analyse ergab, dass die Produktion des Kanalproteins in den Zellen bereits innerhalb von 15 bis 20 Minuten nach der Stimulation einsetzte.

Das gleiche trk1Δ/trk2Δ-Hefesystem wurde in Kapitel III verwendet, um eine mutmaßliche Kanalfunktion des Hüllproteins von SARS-CoV-2 (EpSARS-CoV-2) durch Wachstumsversuche zu testen. Diese zeigen, dass die Expression von EpSARS-CoV-2 das Zellwachstum von trk1Δ/trk2Δ Hefen in kaliumarmem Standardmedium wiederherstellen kann. In Kombination mit luminometrischen Messungen, unterstützen diese Daten die These, dass EpSARS CoV 2 eine K+- und vermutlich auch eine Ca2+- Leitfähigkeit aufweist. Das vorgestellte Wachstumsassay kann für ein Screening nach Inhibitoren für EpSARS-CoV-2 verwendet werden. Kapitel IV beschreibt die Entwicklung neuartiger automatischer Selektionssysteme, die auf der Verwendung essentieller Gene (OLE1 oder CDC19) als Selektionsmarker beruhen. Diese Strategie ermöglicht eine stabile und robuste Selektion von transformierten Hefen in komplexen Medien wie YPD. Die Wirtsstämme (ole1Δ oder cdc19Δ) können in einem komplexen Medium kultiviert werden, das mit den kostengünstigen Verbindungen Ölsäure (für ole1Δ) oder Milchsäure (für cdc19Δ) angereichert ist, was eine einfache Kultivierung und Handhabung der Zellen vor der Transformation ermöglicht. Nach der Transformation mit DNA/Plasmiden, die die Marker OLE1 oder CDC19 enthalten, können die Transformanten stabil selektiert und in komplexem Medium ohne weitere Zusätze vermehrt werden. Diese automatischen Selektionssysteme könnten sich für industrielle Anwendungen als nützlich erweisen, da sie die Kosten für Medium und Zusatzstoffe wie Antibiotika reduzieren. Eine quantitative Analyse ergab eine nahezu 100%ige Retention der OLE1- oder CDC19-basierten Plasmide in komplexem YPD- oder SD-Medium.

Im letzten Kapitel, Kapitel V, wurde ein Screening auf Hefebasis entwickelt, um potenzielle Inhibitoren für Stearoyl-CoA-Desaturasen (SCDs) von Trypanosoma brucei und Trypanosoma cruzi zu identifizieren, die ein vielversprechendes Ziel für die Behandlung von Trypanosoma-Infektionen darstellen. Der ole1Δ-Hefestamm aus dem vorangegangenen Kapitel kann keine ungesättigten Fettsäuren produzieren und kann daher ohne eine Supplementierung von Ölsäure nicht wachsen. Die plasmidbasierte Expression entweder des endogenen S. cerevisiae SCD OLE1 oder der Trypanosoma SCDs ermöglicht das Wachstum des ole1Δ-Stammes in Standard-Hefemedium (YPD oder SD). Eine Einschränkung der Aktivität von Ole1p oder einer der heterolog exprimierten SCDs, entweder durch reduzierte Expression oder durch Hemmung der Proteine, führt zu einem verringerten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Dies resultiert in einer Ausflockung und Wachstumshemmung der Hefen. Beim Testen von drei Verbindungen, Cay 10566, SCD1 Inhibitor A-939572, oder PluriSIn 1, die eine Inhibition humaner SCDs zeigten, wurden bei dem vorliegenden Screening auf Hefebasis starke Unterschiede in der Wirksamkeit der potenziellen Hemmstoffe festgestellt. Cay 10566, das nachweislich die Humane und Murine-SCD1 hemmt, hatte keine Wirkung auf einen der SCDs, während SCD1 Inhibitor A-939572 und PluriSIn 1 eine starke Hemmung von Ole1p und eine noch stärkere Hemmung der Trypanosoma-SCDs zeigten. Daher kann das Hefesystem zum Screening und zur Identifizierung selektiver Inhibitoren der Stearoyl-CoA-Desaturasen von Trypanosoma verwendet werden und bietet somit eine Grundlage für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Trypanosomiasis.