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Struktur und Funktion von Proteasen und Proteaseinhibitoren des Transglutaminaseproduzenten Streptomyces mobaraensis

Juettner, Norbert Egon (2019):
Struktur und Funktion von Proteasen und Proteaseinhibitoren des Transglutaminaseproduzenten Streptomyces mobaraensis.
Darmstadt, Technische Universität,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Struktur und Funktion von Proteasen und Proteaseinhibitoren des Transglutaminaseproduzenten Streptomyces mobaraensis
Language: German
Abstract:

Gegenstände der vorliegenden Arbeit waren der Streptomyces-Subtilisin- und TAMP-Inhibitor (SSTI) und der Streptomyces-Papain-Inhibitor (SPI) von Streptomyces mobaraensis, deren Struktur und Funktion untersucht wurden. Beide Proteine stellten sich in früheren Studien als durch Transglutaminase vernetzbare Proteaseinhibitoren heraus. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der strukturellen Charakterisierung der Proteine durch Röntgenstrukturanalyse, Mutagenesestudien, bio- und physikochemischen Untersuchungen sowie Interaktionsanalysen. Die daraus gewonnenen Informationen sollten dazu dienen, den jeweiligen Inhibierungsmechanismus der Proteine und die Interaktion der inhibitorischen Proteine mit der bakteriellen Transglutaminase aufzuklären, um so die Rolle der sekretierten Proteaseinhibitoren sowie Transglutaminase im Lebenszyklus von S. mobaraensis besser zu verstehen. Zur Charakterisierung des SSTI erfolgte zunächst die rekombinante Produktion des Interaktionspartners, der Transglutaminase-aktivierenden Metalloprotease (TAMP), in E. coli. Untersuchungen mittels isothermaler Titration zeigten die hohe katalytische Effizienz der Metalloprotease gegenüber Transglutaminase und ihre Inhibierung durch das intrinsisch inhibitorische Protein SSTI als Enthalpie-getriebenen Prozess. Mutagenesestudien mit SSTI widerlegten bisherige Erkenntnisse, dass Subtilisin und TAMP an die gleiche Proteinschleife binden. Die Inhibierung des Subtilisin erfolgt, wie durch strukturelle Vergleiche vorhergesagt, in der Loop-Region des Met108. Darüber hinaus wurde jedoch zweifelsfrei bewiesen, dass die Inhibierung der TAMP am N-terminalen Peptid des SSTI durch ein Leu-Tyr-Motiv erfolgt. Über ein stromaufwärts des Leu-Tyr-Motiv lokalisiertes Gln-Gln-Motiv wird zudem die Vernetzung des SSTI mittels MTG ermöglicht. Die generierten Daten legen eine gegenläufige Regulation von SSTI-Vernetzung und TAMP-Inhibierung durch die bekannte Prolyl-tri/tetrapeptidyl-Aminopeptidase von S. mobaraensis nahe. Umfangreiche Untersuchungen bezüglich des Papaininhibitors SPI bestätigten die Zusammensetzung aus einem Protein (SPIP) und einem kleinen peptidischen Molekül, das die inhibitorisch wirksame Komponente (SPIac) darstellt. Bei SPIac handelt es sich um zwei peptidische Aldehydinhibitoren, die sich lediglich durch phenolische Hydroxylgruppen von Chymostatin B unterscheiden. Die Charakterisierung des SPIP ergab eine thermoresistente Double-Psi-Beta-Barrel(DPBB)-Struktur, die durch zwei Cysteinbrücken stabilisiert wird. Der Einbau von Biotinylcadaverin durch MTG identifizierte Gln6 als die einzige Amin-Akzeptorstelle des SPIP. Der Austausch des benachbarten Lysin (Lys7) gegen Glycin und Alanin erhöhte die Markierungsgeschwindigkeit um ein Vielfaches, während die ortsgerichtete Einführung einzelner Argininreste an der Proteinoberfläche keinen Hinweis auf die Interaktion mit Transglutaminase gab. Erst die Struktur eines chloracetylierten Inhibitors, abgeleitet aus dem Proteinsegment an der Glutaminbindestelle von SPIP (Gln6), im katalytischen Spalt ermöglichte einen Einblick in die Interaktion von MTG mit intrinsischen Substraten. Das generierte Peptidmodell legt einen Reißverschluss-ähnlichen Vernetzungsmechanismus von selbstorganisierten Substratproteinen durch MTG nahe.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The major objectives of the present work were the functional and structural characterization of the Streptomyces subtilisin and TAMP inhibitor (SSTI) and the Streptomyces papain inhibitor (SPI) from Streptomyces mobaraensis. Previous studies identified both proteins as protease inhibitors and substrates of the cross-linking enzyme transglutaminase. In the present work, structural characterization of both proteins was performed by X-ray crystallography, site-directed mutagenesis, kinetic as well as protein interaction studies. The obtained information was used to elucidate the respective mechanism of inhibition and the interaction of the inhibitory proteins with the bacterial transglutaminase in order to get a deeper insight into the role of the secreted protease inhibitors and transglutaminase in the life cycle of S. mobaraensis. To characterize SSTI, the recombinant production of the transglutaminase-activating metalloprotease (TAMP) was first established using E. coli. Isothermal titration studies demonstrated the high catalytic efficiency of the metalloprotease towards transglutaminase and its enthalpy-driven inhibition by the intrinsically inhibitory protein SSTI. Mutagenesis studies with SSTI refuted previous findings that the subtilisin and TAMP binding sites are located in the same protein loop. As predicted by sequence alignment, inhibition of subtilisin occurs in the loop region containing Met108. Moreover, the study clearly proved that TAMP was inhibited by a Leu-Tyr motif at the N-terminal peptide of SSTI. A Gln-Gln motif, upstream of the Leu-Tyr motif, was the glutamine donor site of SSTI as depicted by the MTG-mediated incorporation of biotin cadaverine. Thus, the collected data illustrated reverse effects on SSTI cross-linking and TAMP inhibition that are likely regulated by a prolyl tri/tetrapeptidyl aminopeptidase of S. mobaraensis. Extensive studies on the papain inhibitor SPI confirmed the composition of a protein (SPIP) and a small peptidic molecule being the inhibitory compound (SPIac). Upon elaborated separation procedures, structure of SPIac was determined by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. The isolated substance at least consisted of two peptidic aldehyde inhibitors that differ only in phenolic hydroxyl groups from chymostatin B. Characterization of the SPIP revealed a thermo-resistant double psi-beta-barrel (DPBB) structure stabilized by two cysteine bridges. MTG-mediated incorporation of biotin cadaverine identified Gln6 as the only amine acceptor site of SPIP. Furthermore, replacement of the adjacent lysine (Lys7) with glycine and alanine dramatically increased the labeling efficacy. Site-directed replacement of individual arginine residues on the SPIP surface then failed to identify hot spots for the interaction with MTG. However, the crystal structure of MTG inhibited by a chloroacetylated inhibitor based on the N-terminal protein sequence of SPIP surrounding Gln6, allowed insights into the interaction mechanism of MTG with intrinsic substrates. The peptide structure shaped by the catalytic cleft walls of MTG suggested a zipper-like cross-linking mechanism of self-assembled substrate proteins.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 01 Mar 2019 11:43
Last Modified: 09 Jul 2020 02:23
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-81465
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Fuchsbauer, Prof. Dr. Hans-Lothar
Refereed: 10 January 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8146
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