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Mechanisms and factors determining DSB repair pathway choice in G2

Reul, Christian :
Mechanisms and factors determining DSB repair pathway choice in G2.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Mechanisms and factors determining DSB repair pathway choice in G2
Language: English
Abstract:

Aim of this work was to investigate the interplay between the different DNA double-strand break (DSB) repair pathways during the G2 phase of the cell cycle. In G2, DSBs which are located in euchromatic regions are repaired with fast kinetics via canonical NHEJ (c-NHEJ), whereas heterochromatic DSBs are repaired with slow kinetics via homologous recombination (HR). C-NHEJ comprises a ligation of both DSB ends without the requirement of sequence homology. HR is a repair pathway, where the DSB ends are resected to produce ssDNA that invades the sister chromatid and uses the sequence as a template for error-free repair. If cells are deficient in the HR core factors BRCA2 or RAD51, the DSBs are resected but remain unrepaired. This can lead to genomic instability, less cell survival and cancer. The presence of ssDNA itself might explain why c-NHEJ does not repair resected DSBs in a BRCA2 deficient cell to prevent an accumulation of unrepaired DSBs. But an alternative NHEJ (alt-NHEJ) process is described, which uses microhomologies within the ssDNA to ligate both resected DSB ends. Therefore we sought to further characterize resected DSBs in G2 and observed an ATM release at resected DSBs. In G1, ATM is assembled at DSBs and facilitates the repair of heterochromatic DSBs by heterochromatin relaxation due to the phosphorylation of the heterochromatin building factor KAP-1. Contrary to G1, in G2 is ATM needed to initiate resection but is dispensable for later stages of HR. A permanent heterochromatin relaxation by downregulation of KAP-1 or expression of a phosphomimic form of KAP-1 allows the repair of resected DSBs in BRCA2- or RAD51-deficient cells by error-prone alt-NHEJ. Moreover, in HR proficient cells a KAP-1 depletion causes a switch from HR to alt-NHEJ repair, too. We support a model, where the heterochromatin is initially relaxed, but after extended resection, the heterochromatin is reconstituted due to the release of ATM and the dephosphorylation of KAP-1. The restored heterochromatin structure now facilitates error-free HR and prevents the usage of error-prone alt-NHEJ. Secondarily, we investigated the mechanistic reason of the ATM release at resected DSBs. The cascade of the assembly of ATM at DSBs involves first the phosphorylation of H2AX by ATM itself and the binding of MDC1 to this phosphorylation. ATM phosphorylates MDC1 to allow the binding of the ubiquitin ligase RNF8, which together with RNF168, ubiquitinates Summary 4 the histone H2A/H2AX and the demethylase JMJD2A. JMJD2A is bound at H4K20me2 and degraded after its ubiquitination. After the degradation of JMJD2A, 53BP1 has the ability to bind H4K20me2 that in turn allows the assembly of ATM at the DSB site. We were able to show that at resected DSBs, 53BP1 is released and RNF8/168 actity is decreased, whereas H2AX phosphorylation and MDC1 binding are not affected. A switch from ATM to ATR activity at resected DSBs allows H2AX phosphorylation and MDC1 binding. But ATR cannot phosphorylate MDC1, so RNF8/168 activation is impaired. Without the RNF8/168 activity, 53BP1 cannot bind H4K20me2 and assemble ATM at the resected break. This leads to a heterochromatin reconstitution, which facilitates HR and prevents alt-NHEJ. A co-depletion of JMJD2A and JMJD2B is described to allow 53BP1 binding in RNF8/168 deficient cells. This co-depletion or using a phosphomimic form of MDC1, which mimics a permanent phoshporylation to allow RNF8/168 activity at resected DSBs, allows the repair of heterochromatic DSBs in BRCA2-deficient cells. We suggest that under such conditions cells switch to alt-NHEJ instead of using HR, equal to a KAP-1 knockdown. In summary, our results provide a model where the resection is the most important step of the HR process, which determines the repair of a heterochromatic DSB to HR and exclude end-joining repair: not the resection per se, but rather the heterochromatin reconstitution in consequence of ATM release at resected DSBs. ATM is released due to the inability of ATR to phosphorylate MDC1to trigger RNF8/168 activition. We suggest that without RNF8/168 activity, JMJD2A replaces 53BP1 at resected DSBs. Without 53BP1, ATM is released and the heterochromatin structure is reconstituted.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ziel dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel der verschiedenen DSB-Reparaturwege in der G2-Phase des Zellzykluses zu untersuchen. In der G2-Phase werden euchromatische DSBs mit schneller Kinetik über das kanonische NHEJ (c-NHEJ) repariert, während heterochromatische DSBs mit langsamer Kinetik über HR repariert werden. Das c-NHEJ beinhaltet eine sequenzunabhängige Ligation der DSB-Enden. Die HR hingegen ist ein Reparaturweg, bei dem die DSB-Enden erst resektiert werden, um einzelsträngige DNA-Bereiche freizulegen, welche dann im Anschluss in das Schwesterchromatid einwandern und dessen homologe Sequenz als Vorlage für eine fehlerfreie Reparatur verwende wirdt. In Zellen, welche in den HR-Kernfaktoren BRCA2 oder RAD51 defizient sind, verbleiben die resektierten DSBs unrepariert. Dies kann zu genomischer Instabilität, geringerem Zellüberleben bis hin zur Krebsentstehung führen. Die Präsenz einzelsträngiger DNA an sich könnte erklären, warum resektierte DSBs in BRCA2-defizienten Zellen nicht über c-NHEJ reparieren werden, um eine Akkumulation unreparierter DSBs zu verhindern. Es ist allerdings ein alternativer NHEJ (alt-NHEJ)-Reparaturweg beschrieben, welcher Mikrohomologien innerhalb einzelsträngiger DNA nutzen kann, um die resektierten DSB-Enden zu ligieren. Daher wurden diese resektierten DSBs in der G2-Phase von uns genauer untersucht und wir konnten ein Ablösen von ATM an diesen resektierten DSBs beobachten. In der G1-Phase akkumuliert ATM an DSBs und fördert die Reparatur heterochromatischer DSBs durch eine Relaxation des Heterochromatins aufgrund einer Phosphorylierung des Heterochromatin-bildenden Faktors KAP-1. Im Gegensatz zur G1-Phase wird in der G2-Phase ATM benötigt, um die Resektion zu initiieren, während es für spätere Schritte der HR verzichtbar ist. Eine permanente Heterochromatin-Relaxation mit Hilfe einer KAP-1-Depletion oder der Expression einer dauerhaft phosphorylierten Form von KAP-1 erlaubt die Reparatur resektierter DSBs in BRCA2- oder RAD51-defizienten Zellen über das alt-NHEJ. Desweiteren führt eine KAP-1-Depletion in HR-profizienten Zellen ebenfalls zu einem Wechsel von HR zu alt-NHEJ. Wir schlagen ein Modell vor, in dem das Heterochromatin initial relaxiert wird, aber nach einer ausgedehnten Resektion die Heterochromatinstruktur als Folge der ATM-Ablösung vom Chromatin und der darauf folgenden KAP-1-Dephosphorylierung wiederhergestellt wird. Desweiteren wurde der mechanistische Grund für das Ablösen von ATM an resektierten DSBs untersucht. Die Kaskade der ATM-Akkumulierung an DSBs beinhaltet zuerst eine Summary 6 Phosphorylierung von H2AX durch ATM und der Bindung von MDC1 an diese Phosphorylierung. Danach phosphoryliert ATM MDC1, um die Bindung der Ubiquitinligase RNF8 zu erlauben, welche zusammen mit RNF168 die Histone H2A/H2AX und die Demethylase JMJD2A ubiquitiniert. JMJD2A bindet normalerweise an H4K20me2 und wird nach seiner Ubiquitinierung abgebaut. Nach dem Abbau von JMJD2A kann 53BP1 an H4K20me2 binden, was wiederum die Akkumulierung von ATM am DSB fördert. Es konnte gezeigt werden, dass an resektierten Brüchen 53BP1 abgelöst wird und die Aktivität von RNF8/168 verringert ist, während die H2AX-Phoshporylierung und MDC1-Bindung nicht beeinträchtigt ist. Ein Wechsel von einer ATM- zu einer ATR-Aktivität an resektierten DSBs erlaubt weiterhin eine H2AX-Phosphorylierung und MDC1-Bindung. Allerdings kann ATR MDC1 nicht phosphorylieren, wodurch die RNF8/168-Aktivität beeinträchtigt wird. Ohne RNF8/168-Aktivität kann 53BP1 nicht an H4K20me2 binden, um ATM an resektierten DSBs zu akkumulieren. Dies führt zu einer Rekonstitution der Heterochromatinstruktur, welche HR fördert und dadurch die Reparatur über alt-NHEJ verhindert. Es ist bekannt, dass eine Co-Depletion von JMJD2A und JMJD2B die 53BP1-Bindung in RNF8/168 defizienten Zellen erlaubt. Diese Depletion oder das Verwenden einer dauerhaft phosphorylierten Formvon MDC1, was eine RNF8/168-Aktivität an resektierten DSBs ermöglicht, erlaubt die Reparatur heterochromatischer DSBs in BRCA2-defizienten Zellen. Unter diesen Umständen scheinen die Zellen anstatt HR zu verwenden, in alt-NHEJ zu wechseln, ähnlich wie nach einer KAP-1-Depletion. Zusammengefasst unterstützen unsere Ergebnisse ein Modell, in dem die Resektion der wichtigste Schritt des HR-Prozesses ist, welcher die Reparatur heterochromatischer DSBs für HR determiniert und alt-NHEJ ausschließt: nicht die Resektion per se, sondern die Rekonstitution des Heterochromatins als Konsequenz des Ablösens von ATM an resektierten DSBs. ATM wird abgelöst, da ATR nicht in der Lage ist MDC1 zu phosphorylieren, um RNF8/168 zu aktivieren. Vermutlich wird ohne RNF8/168-Aktivität JMJD2A das gebundene 53BP1 an resektierten DSBs ersetzen. Ohne diese 53BP1-Bindung wird ATM abgelöst und die Heterochromatinstruktur wiederhergestellt.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 01 Sep 2014 08:51
Last Modified: 01 Sep 2014 08:51
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-40989
Referees: Löbrich, Prof. Markus and Laube, Prof. Bodo
Refereed: 23 April 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4098
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