TU Darmstadt / ULB / TUprints

Über die Charakterisierung und funktionelle Produktion der Oligomerisierungsdomäne des humanen C4b-Bindeproteins

Hofmeyer, Thomas :
Über die Charakterisierung und funktionelle Produktion der Oligomerisierungsdomäne des humanen C4b-Bindeproteins.
TU Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

[img]
Preview
Text
Dissertation Thomas Hofmeyer.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No Derivatives, 2.5.

Download (12MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Über die Charakterisierung und funktionelle Produktion der Oligomerisierungsdomäne des humanen C4b-Bindeproteins
Language: German
Abstract:

Im Zuge der vorliegenden Arbeit sollte die C-terminale Oligomerisierungsdomäne des humanen C4BP (complement component C4b-binding protein) für Anwendungen als Grundgerüst und Adjuvans in der molekularen Biochemie näher charakterisiert werden. Darüber hinaus sollte das Expressionssystem in der nichtkonventionellen Hefe Yarrowia lipolytica anhand der heterologen Produktion von drei Modellproteinen als Expressionssystem für C4BP-basierte Homo- und Heterooligomere evaluiert werden. Zunächst konnte die Kristallstruktur der C-terminalen Oligomerisierungsdomäne der 7α-Isoform des humanen C4BP mittels SAD (single wavelenght molecular displacement) über den Einbau der nicht kanonischen Aminosäure Selenomethionin aufgeklärt werden (PDB-ID: 4B0F). Die heptamere Struktur lässt sich in der Aufsicht als torusförmig und in der Seitenansicht als champagnerkorkenförmig beschreiben. Neben sieben intermolekularen Disulfidbrücken wird das Heptamer zusätzlich durch drei Schichten intermolekularer Wechselwirkungen entlang der Vertikalachse durchspannt. Mittels CD-Spektroskopie und Thermofluormessungen wurden diverse C4BP-Varianten auf ihre Stabilität, Toleranz gegenüber von Mutationen und Aminosäureaustauschen untersucht. Die Kristallstruktur der 7α-Isoform diente daraufhin als Ausgangspunkt zur Erstellung von in silico Modellen der drei übrigen natürlich vorkommenden C4BP-Isoformen (7α1β, 6α1β, 6α). Die hierbei vorgeschlagene Positionierung der β-Kette ist plausibel, trotzdem bleiben Fragen hinsichtlich der Assemblierung, Tätigkeit von Chaperonen und in vivo Regulation unbeantwortet. Eine in vitro Darstellung von Heterooligomeren aus rekombinant hergestellten α- und β-Untereinheiten konnte nicht realisiert werden. Dennoch lieferten Experimente in dieser Richtung Erkenntnisse über die beeindruckende Rückfaltungsfähigkeit der Oligomerisierungsdomäne. Durch die sukzessive Verkürzung der C-terminalen Oligomerisierungsdomäne des humanen C4BP konnte eine Minimalvariante identifiziert werden, die nach wie vor zur Oligomerisierung in der Lage ist, jedoch anstelle von 66 nur noch aus 37 Aminosäuren besteht. Diese Minimalsequenz ermöglicht die Synthese von monomeren Peptiden mittels Festphasensynthese. Mit dieser Technik können nun in Kombination mit der Kristallstruktur mehrfachfunktionalisierte Monomere synthetisiert werden. Darüber hinaus liegt nun der Austausch einiger oder aller Aminosäuren mit D- anstelle von L-Konfiguration im Bereich des Möglichen. Somit ist eine zusätzliche Steigerung der Gesamtstabilität und Verlängerung der in vivo Halbwertszeit denkbar. Das Yarrowia lipolytica Expressionssystem wurde auf seine Fähigkeit zur heterologen Produktion von C4BP-basierten Homo- und Heterooligomeren untersucht. Hierbei konnten die in Größe, Komplexität und phylogenetischem Ursprung sehr unterschiedlichen Modellproteine (MCoTI, Tryp-VHH, Goase M1) als Lip2p-Fusionen in guten Ausbeuten produziert werden. Durch individuelle Aktivitätstests (Inhibitionstest, Bindungstest und ABTS-Test) konnte die funktionelle Faltung der heterolog produzierten Proteine bestätigt werden. Eine Steigerung der erzielten Ausbeuten ist durch Optimierung des codon usage, der Fermentationsbedingungen sowie der Reinigungsstrategie vorstellbar. Schließlich bietet es sich nun an, in Yarrowia lipolytica die Produktion von C4BP-basierten Fusionsproteinen zu untersuchen. Möglicherweise lassen sich mit diesem eukaryotischen Expressionssystem rekombinant funktionalisierte Oligomere realisieren, die in einer E. coli Expression unzugänglich waren.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of this work was the exploitation of the C-terminal oligomerization domain of human C4BP (complement component C4b-binding protein) for applications as scaffold and adjuvant in the field of molecular biochemistry. Furthermore an expression system in the yeast Yarrowia lipolytica was evaluated for its potential as production system for C4BP based homo- and hetero oligomers. The evaluation was realized by recombinant production of three different model proteins. Within this study it was possible to solve the crystal structure of the C-terminal oligomerization domain of the 7α-isoform of human C4BP. This was achieved using isomorphic replacement exploiting the anomalous signal of selenium (PDB-ID: 4B0F). The heptameric structure has a torus-like shape in top view and a champagne cork-like shape in side view. In addition to the intermolecular disulfide bridges the oligomerization domain is stabilized by three layers of intermolecular interactions. CD-spectroscopy and Thermofluor measurements of different variants resulted in the accumulation of data about stability and tolerance of the oligomerization domain in respect to mutations as well as amino acid exchanges. The crystal structure of the 7α-isoform served as starting point for the generation of in silico models of the three other naturally occurring C4BP-isoforms (7α1β, 6α1β, 6α). In this context, the proposed positioning of the β-chain in the hetero oligomers appears to be rational. However, crucial questions concerning the assembling process e.g. the involvement of chaperons or in vivo regulation of subunit composition remain unclear. An in vitro polymerization of heterologous produced subunits was not achieved. However, these experiments yielded insights into the remarkable refolding capability of the oligomerization domain which might be useful in further experiments towards discrimination and separation of functionalized monomers. By successive truncation from the C- as well as the N-terminus of the C4BP α oligomerization domain it was possible to identify the part crucial for assembly and subunit polymerization. This minimal sequence comprises of 37 amino acids instead of 66 present in the wild type protein. Polymerization is initiated at the C-terminal helices H2 of the oligomerization domain. The N-terminal helices H1 do not seem to be involved in subunit polymerization. These insights in combination with the crystal structure enable for the exchange of some or all amino acids from L- to D-configuration, possibly further increasing overall stability and in vivo half-life. The expression system in the unconventional yeast Yarrowia lipolytica was evaluated as potential production system for C4BP-based homo and hetero oligomers. Using this system, it was possible to produce three model proteins (MCoTI, Tryp-VHH, Goase M1). These proteins, very different in there phylogenetic background, as well as size and complexity were secreted as Lip2p-fusion proteins resulting in reasonable yields and purity. Furthermore, the functionality of each protein was confirmed by individual activity assays (inhibition assay, binding assay and ABTS assay). However, the yield of protein of interest might be further increased by optimization of codon usage, fermentation conditions as well as the purification strategy. Finally, the capability of the Yarrowia lipolytica expression system should be tested for the production of functionalized C4BP oligomers. Possibly enabling for the recombinant production of fusion proteins, which were inaccessible by E. coli expression systems. English
Series Name: Dissertation
Place of Publication: Darmstadt
Publisher: TU Darmstadt
Uncontrolled Keywords: C4BP, C4b-Bindeprotein, Oligomerisierungsdomäne
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
C4BP, complement component C4b-binding protein, scaffoldUNSPECIFIED
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 12 Nov 2013 08:44
Last Modified: 15 Nov 2013 09:49
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-36727
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Refereed: 29 October 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3672
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year