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Aktivierung und Reprimierung der Gasvesikelbildung in Haloferax mediterranei

Zimmermann, Peter :
Aktivierung und Reprimierung der Gasvesikelbildung in Haloferax mediterranei.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2003)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Aktivierung und Reprimierung der Gasvesikelbildung in Haloferax mediterranei
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit wurde die Aktivierung und Reprimierung der Gasvesikelbildung in dem halophilen Archaeon Haloferax mediterranei untersucht. Hf. mediterranei bildet nur in der stationären Wachstumsphase Gasvesikel, an deren Bildung 14 verschiedene gvp-Gene beteiligt sind, die in zwei entgegengesetzt orientierten Gengruppen liegen (gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM) und unter der Kontrolle des mcA- und des mcD-Promotors stehen. Transkripte, die für die Strukturproteine kodieren, werden nur während der stationären Wachstumsphase gebildet und an dieser Regulation sind der Transkriptionsaktivator GvpE und das repressorisch wirkende GvpD beteiligt. Northern-Analysen mit Hf. volcanii-Transformanten, die nur die Gene gvpA, gvpD und gvpE enthalten, zeigten, dass die Anwesenheit von GvpD nicht ausreichte, um die GvpE-abhängige Aktivierung des mcA-Promotors zu verhindern. Dies konnte nur durch eine starke Überexpression von gvpD unter fdx-Promotor-Kontrolle erreicht werden. Eine Reprimierung des mcA-Promotors bei Expression von gvpD unter der nativen Kontrolle konnte dagegen nur in Transformanten beobachtet werden, die zusätzlich gvpF oder gvpN zu gvpADE enthielten. Mit dem Reportergen bgaH, das für ein halophiles Protein mit einer ß-Galaktosidase-Aktivität kodiert, wurde der Einfluß von GvpD, GvpE und GvpF auf die Expression eines mcA-bgaH-Konstruktes in einer quantitativeren Weise analysiert. In verschiedenen Versuchsreihen wurde der Einfluß dieser Proteine auf die mcA-Promotor-abhängige Expression unter der nativen Kontrolle des mcD-Promotors oder unter der Kontrolle des fdx-Promotors unter-sucht. Der Transkriptionsaktivator GvpE führte bereits in geringen Mengen bei Abwesenheit von GvpD immer zu sehr hohen mcA-Promotor-abhängigen ß-Galaktosidase-Aktivitäten. Nur unter der Kontrolle des mcD-Promotors exprimiertes gvpD und gvpE führte zu einer negativen Beeinflussung der GvpE-vermittelten Aktivierung des mcA-Promotors, während die gemeinsame Überexprimierung von gvpDE unter fdx-Promotor-Kontrolle zu keiner Repression des mcA-Promotors führte. Diese unterschiedlichen Ergebnisse waren vermutlich auf das größere nachgewiesene Mengenverhältnis von GvpD zu GvpE in den Transformanten unter nativer Kontrolle zurückzuführen. Die zusätzliche Expression von gvpF führte dagegen nur bei gemeinsamer Überexprimierung von gvpDEF zu einer negativen Beeinflussung der GvpE-vermittelten Aktivierung des mcA-Promotors, wohingegen die GvpF-Menge bei nativer Kontrolle durch den mcD-Promotor in den entsprechenden Hf. volcanii-Transformanten zu gering war, um die GvpE-vermittelte Aktivierung des mcA-Promotors zu beeinflussen. Für den Nachweis des zeitlichen Auftretens der Proteine GvpD, GvpE und GvpF während des Wachstums von Hf. mediterranei wurden Antiseren gegen die entsprechenden, rekombinant in E. coli produzierten und isolierten Proteine generiert. Die jeweiligen Antiseren detektierten GvpD und GvpE in der stationären Wachstumsphase, wohingegen GvpF vorwiegend in der exponentiellen Wachstumsphase nachgewiesen wurde. Für die Charakterisierung der Funktion der drei genannten Proteine sowie der Proteine GvpC, GvpN und GvpG wurde mittels Protein-Protein-Affinitätschromatographie nach möglichen Bindungspartnern gesucht. Dafür wurden die entsprechenden, aus E. coli isolierten Gvp-His-Proteine koordinativ an eine Ni-NTA-Matrix gebunden und mit löslichen Proteinen aus Hf. mediterranei inkubiert. Mit der GvpD-His-Matrix konnte ein Protein mit der molekularen Masse von ca. 21 kDa gebunden werden, das mittels Western-Analyse als GvpE identifiziert wurde. Umgekehrt konnte mit der GvpE-His-Matrix GvpD aus löslichen Proteinen von Hf. mediterranei angereichert werden. Mit der GvpF-His-Matrix konnte mit einem GvpA-spezifischen Antiserum die Bindung von GvpA-Aggregaten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse geben einen guten Hinweis darauf, dass GvpD und GvpE bzw. GvpF und GvpA auch in vivo miteinander interagieren. In weiteren Analysen konnte mit Hf. volcanii-Transformanten, die veränderte Varianten von GvpD (GvpDmut-Proteine) produzierten, gezeigt werden, dass ein p-loop-Motiv (mögliches ATP-/GTP-Bindemotiv) sowie zwei basische Regionen in der Aminosäuresequenz von GvpD wichtig für die Reprimierung der GvpE-vermittelten Aktivierung des mcA-Promotors sind. Untersuchungen mit gereinigtem GvpD-His zeigten, dass das Protein ATP aus einem ATP-haltigen Puffer binden konnte.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In this thesis the activation and repression of gas vesicle formation in the halophilic archaeon Haloferax mediterranei was investigated. Hf. mediterranei produces gas vesicles only during the stationary growth phase. 14 different gvp genes are involved that are arranged in two oppositely oriented gene clusters, gvpACNO and gvpDEFGHIJKLM, under the control of the mcA and mcD promoters, respectively. Transcripts coding for the structural proteins are formed only during the stationary growth phase, and this regulation involves the participation of the transcriptional activator GvpE and the repressive acting GvpD. Northern analysis with Hf. volcanii transformants containing only the genes gvpA, gvpD and gvpE showed that the presence of GvpD was not sufficient to prevent the GvpE-dependent activation of the mcA promoter. This could only be achieved by a strong overexpression of gvpD under the control of the fdx promoter. A repression of the mcA promoter while expressing gvpD under native control was only detectable with transformants containing gvpF or gvpN in addition to gvpADE. The reporter gene bgaH, which codes for a halophilic protein with a ß-galactosidase activity, was used to analyse the influence of GvpD, GvpE and GvpF on the expression of an mcA-bgaH construct in a more quantitative way. The influence of these proteins on the mcA promoter-dependent expression was analysed in different experimental series under the native control of the mcD promoter or under the control of the fdx promoter. Even small amounts of the transcriptional activator GvpE led consistently to very high mcA promoter-dependent ß-galactosidase activities when GvpD was absent. Only the expression of gvpD and gvpE under the control of the mcD promoter negatively affected the GvpE-mediated activation of the mcA promoter, whereas the simultaneous overexpression of gvpDE under fdx promoter-control did not lead to a repression of the mcA promoter. These different results were presumably due to the larger amount of GvpD in relation to GvpE detected in transformants with the genes under native promoter control. On the other hand the additional expression of gvpF negatively affected the GvpE-mediated activation of the mcA promoter only through simultaneous overexpression of gvpDEF. The amount of GvpF was too low in the case of native control by the mcD promoter to influence the GvpE-mediated activation of the mcA promoter. To analyse the time-dependent appearance of the proteins GvpD, GvpE and GvpF during the growth of Hf. mediterranei, antisera were raised against the respective isolated proteins recombinantly produced in E. coli. The respective antisera detected GvpD and GvpE in the stationary growth phase, whereas GvpF was mainly detectable in the exponential growth phase. For the characterisation of the function of these three proteins as well as that of the proteins GvpC, GvpN and GvpG, protein-protein affinity chromatography was used to search for putative binding partners. For this reason the respective Gvp-His proteins isolated from E. coli were bound coordinatively to a Ni-NTA matrix and incubated with soluble proteins from Hf. mediterranei. A protein with the molecular mass of approximately 21 kDa was bound using the GvpD-His matrix that could be identified as GvpE by western analysis. Vice versa, GvpD could be enriched from soluble proteins of Hf. mediterranei using the GvpE-His matrix. The binding of aggregates of GvpA to the GvpF-His matrix could be demonstrated with a GvpA-specific antiserum. These results give a good indication that GvpD interacts with GvpE and also GvpF with GvpA in vivo. In further analyses with Hf. volcanii transformants that produced altered variants of GvpD (GvpDmut proteins) it could be demonstrated that a p-loop motif (putative ATP/GTP binding motif) and two basic regions in the amino acid sequence of GvpD are important for the repression of the GvpE-mediated activation of the mcA promoter. Analyses with purified GvpD-His demonstrated that the protein could bind ATP from an ATP-containing buffer.English
Uncontrolled Keywords: Archaea, Gasvesikel, Haloferax mediterranei
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Archaea, Gasvesikel, Haloferax mediterraneiGerman
Archaea, gene regulation, gas vesicles, halobacteria, Haloferax mediterraneiEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:49
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000329
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-3295
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Felicitas, Prof. Dr. Pfeifer and Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn
Advisors: Felicitas, Prof. Dr. Pfeifer
Refereed: 2 May 2003
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/329
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