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Charakterisierung humaner Cytochrom-P450-Enzyme in transplastomen Tabakpflanzen am Beispiel des CYP2A6

Urbank, Susan :
Charakterisierung humaner Cytochrom-P450-Enzyme in transplastomen Tabakpflanzen am Beispiel des CYP2A6.
TU Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Charakterisierung humaner Cytochrom-P450-Enzyme in transplastomen Tabakpflanzen am Beispiel des CYP2A6
Language: German
Abstract:

Cytochrom-P450-Enzyme als vielseitige Biokatalysatoren stellen bedeutende Werkzeuge für ein gezieltes Metabolic Engineering dar. Damit eröffnen sich vielfältige neue Möglichkeiten für einen gezielten Eingriff in den pflanzlichen Sekundärstoffwechsel, vor allem in Hinblick auf die Erzeugung neuer pharmakologisch aktiver Substanzen in Medizinalpflanzen. Die Beobachtung, dass rekombinante E. coli Kulturen bei Expression des humanen CYP2A6 in der Lage waren, endogenes Indol zu hydroxylieren und zur Bildung von Indigo beizutragen, warf die Frage auf, ob ein Eingriff in den Sekundärmetabolismus von Tabakpflanzen ebenfalls zur Bildung von Indigo führen kann. Vorarbeiten zeigten, dass die Expression von CYP2A6 im Kerngenom nicht zur Bildung von Indigo, sondern lediglich zu einer geringen Synthese des Glycosids Indican führte. Da die Expressionslevel eher gering und auch nicht stabil waren, sollte in dieser Arbeit evaluiert werden, ob die Integration des Transgens CYP2A6 in das Chloroplastengenom zu einer gesteigerten Expression und auch zu einer höheren Akkumulationsrate der Metabolite führt. Ebenfalls sollte untersucht werden, ob aufgrund des Fehlens von Glykosyltransferasen in den Chloroplasten die direkte Bildung von Indigo möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression des humanen CYP2A6 im Chloroplastengenom unter Verwendung der Vektoren pNT2 und pRB95 und des Promotors psbA grundsätzlich möglich ist. Es stellte sich heraus, dass die Expressionslevel der transplastomen Pflanzen sehr gering waren und mit zunehmenden Pflanzenalter weiter abnahmen, sodass nach etwa sechs Wochen kein CYP2A6 Protein mehr detektiert werden konnte. Die Gründe hierfür sind auf eine generell schwache RNA-Synthese als auch auf die Instabilität der mRNA zurückzuführen. Fütterungsexperimente zeigten jedoch, dass das gebildete humane Cytochrom in der Lage ist, bereitgestelltes Indol zu hydroxylieren. Da keine zusätzliche Expression einer NADPH-Reduktase erfolgte, werden die für die Aktivität des Cytochroms benötigten Reduktionsäquivalente durch noch nicht bekannte andere Mechanismen bereitgestellt. Die Optimierung des Expressionssystems durch Verwendung einer Kodon-optimierten CYP2A6-Sequenz sowie durch Verwendung eines konstitutiven Promotors führte zwar zu größeren Mengen an stabiler RNA, jedoch zu keiner gesteigerten Proteinsynthese. Im Gegenteil, es konnte zu keiner Zeit Protein detektiert werden, was wahrscheinlich auf eine falsche Faltung des Proteins und einen daraus resultierenden frühzeitigen Proteinabbau zurückzuführen ist. Trotzdem konnte auch hier die Bildung geringer Mengen Indican nachgewiesen werden. Abschließend kann gesagt werden, dass auch die Expression vonCYP2A6 im Chloroplastengenom nicht zur Änderung des Phänotyps der Pflanze durch Bildung von Indigo führt und in diesem Fall die geringe Expression als auch die Glykosylierung von Indoxyl limitierende Faktoren für das gezielte Metabolic Engineering darstellen.

Da über Chloroplasten-lokalisierte NADPH-Reduktasen bisher nichts bekannt ist, wurde die NADPH-Reduktase ATR2 aus Arabidopsis thaliana näher charakterisiert. Dabei waren zwei Sequenzmerkmale von besonderem Interesse. Das ist zum einen die N-terminale Signalsequenz, die eine Lokalisation des Proteins in den Chloroplasten vorhersagen lässt, zum anderen das Vorkommen einer Lipobox, die als typisches bakterielles Lipidierungssignal bekannt ist. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass bei Expression des Reduktase-Gens in Bakterien der N-Terminus erkannt wird und dies zur Lipidierung des Proteins führt. Ebenso führt eine Mutation des essenziellen Cystein innerhalb der Lipobox nicht zur Lipidierung des Proteins. Weiter konnte dargelegt werden, dass die Signalsequenz bei Expression in Pflanzen nicht als Lipidierungssignal erkannt wird und somit keine Lipidierung erfolgt, unabhängig von der Mutation als auch unabhängig vom Fehlen des N-Terminus. Abschließend kann außerdem die wichtigste Aussage getroffen werden, dass ATR2 anders als bisher vermutet, nicht im Chloroplasten lokalisiert ist.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Cytochrome-P450-enzymes as versatile biocatalysts are promising tools for specific metabolic engineering. Thus, it opens up many new possibilities for targeted intervention in the plant secondary metabolism, especially with regard to the generation of new pharmacologically active substances in medicinal plants. The observation, that recombinant E. coli cultures expressing the human cytochrome CYP2A6 were able to hydroxylate endogenous indole, which leads to the formation of indigo, raised the question whether an intervention in the secondary metabolism of tobacco plants also can cause the formation of indigo. It was demonstrated in previous work that the expression of CYP2A6 in the nucleus does not lead to the formation of indigo, but only to the synthesis of the glycoside indican. Since the expression levels were rather low and not stable, it should be evaluated, whether the integration of the CYP2A6-cDNA into the chloroplast genome results in an increased expression and also leads to a higher accumulation rate of the metabolites. It should also be investigated, if the direct formation of indigo is possible, due to the putative absence of glycosyltransferases in the chloroplasts. In the present study it was shown, that the expression of human CYP2A6 from the chloroplast genome using the vectors pNT2 and pRB95 and the promotor psbA is generally possible. It turned out, that the expression levels in transplastomic plants were very low and decreased with an increasing plant age. No CYP2A6 protein could be detected after about six weeks. The reason can be seen in a generally weak RNA synthesis as well as in the instability of the mRNA. Feeding experiments showed that the synthesized human cytochrome is able to hydroxylate the provided indole. Since no additional reductase was expressed, mechanisms providing the reduction equivalents required for the activity of the cytochrome are still unknown. The optimization of the expression system with the help of a codon optimized CYP2A6 sequence and of a constitutive promoter, indeed, led to larger amounts of stable RNA. However, no increase in protein synthesis could be detected. This might be due to an incorrect folding of the protein and a consequential premature protein degradation. Nevertheless, the formation of small amounts of indican could be detected and assigned tolittle amounts of active protein. In conclusion, the expression of CYP2A6 within the chloroplast genome did not lead to phenotypic changes of the tobacco plant forming indigo. In this case, the low expression and also the glycosylation of indoxyl are limiting factors for the targeted metabolic engineering. As chloroplast localized NADPH-reductases have not been studied so far, the NADPH reductase ATR2 from Arabidopsis thaliana was characterized in detail. Here, two sequence features were of particular interest. Firstly, the N-terminal signal sequence which predicts a localization of the protein within the chloroplast, and secondly the occurrence of a Lipobox which is known as a typical bacterial lipidation signal. It could be shown that during expression of the reductase gene in bacterial cells the N-terminus is recognized and this leads to the lipidation of the protein. A mutation of the essential cysteine within the Lipobox abolishes lipidation of the protein as well. Furthermore, it could be demonstrated that this signal sequence does not act as a lipidation signal when expressed in plants and thus no lipidation occurs, independent of the mutation and also independent of the absence of the Nterminus. Most important, it could be shown that the protein is not located within the chloroplast.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 19 Jun 2012 11:35
Last Modified: 07 Dec 2012 12:05
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-30099
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Warzecha, Prof. Dr. Heribert and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 18 May 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3009
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