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Sulfur Oxygenase Reductases - A Structural and Biochemical Perspective

Veith, Andreas :
Sulfur Oxygenase Reductases - A Structural and Biochemical Perspective.
TU Darmstadt Fachbereich Biologie
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Sulfur Oxygenase Reductases - A Structural and Biochemical Perspective
Language: English
Abstract:

Sulfur oxygenase reductases (SORs) catalyze the oxygen-dependent disproportionation reaction of elemental sulfur with sulfite, thiosulfate and sulfide as products. The SOR is the initial sulfur-oxidizing enzyme in the hyperthermophilic and chemolithoautotrophic archaeon Acidianus ambivalens. Although the enzyme is biochemically and structurally well characterized, details on the reaction mechanism are still unknown. Here, structure-function relationships of the SOR are analyzed using site-directed mutagenesis, metal substitution, spectroscopic methods and X-ray crystallography. In addition, the first characterization of a SOR from a mesophilic microorganism is presented. It was hypothesized that the initial SOR substrate is a linear sulfur species and not α-S8. An in-gel enzyme activity assay was performed with the Acidianus ambivalens SOR (AaSOR), demonstrating enzyme activity with the linear polysulfide. The outer shell of the spherical and hollow enzyme harbors two different channel types at the rotational fourfold and threefold symmetry axes. They allow the entrance of the sulfur substrate and the exit of reaction products, respectively. Both pores were enlarged via site-directed mutagenesis, resulting in an up to fourfold elevated enzyme activity and causing a change of the proposed 1:1 stoichiometry of oxidized and reduced products. A small hydrophobic pore allows access to the active site, which resides in a small pocket separated from the inner hollow. The pore was enlarged using site-directed mutagenesis, but expansion led to a significant decrease of enzyme activity. Zn2+, a strong SOR-inhibitor, was previously localized in a blind-ending channel that opens near the active site entry pore and which is far from the catalytic center itself. Zn coordination was analyzed using previously obtained crystallographic data, indicating that two histidines are involved. Alanine mutants of both histidines tripled the Ki values in comparison to the wild type enzyme. It was concluded that both histidines are essential for zinc ligation. The active site comprises a cysteine persulfide and a mononuclear iron center coordinated by two histidines and one glutamate. Diffraction data from re-crystallized AaSOR were analyzed, showing the cysteine in an unmodified form. The results pointed to a heat-induced auto-sulfuration process that converts C31 into a cysteine persulfide. An H-bond network was hypothesized to be centered around the catalytic site. Several amino acids, expected to be interacting with essential active site residues, were mutated. Most of the variants had moderately diminished activities. The substitution of a single glutamate (E87), located in H-bond distance to one of the iron-binding histidines, almost abolished enzyme activity. An aspartate variant (E87D) with slightly lowered catalytic activity was crystallized. Analyses of the diffraction data showed nearly identical H-bond distances between the histidine and the aspartate, indicating the importance of an interaction between both residues. Previous EPR experiments demonstrated a redox change of the active site iron from Fe3+ to Fe2+ upon incubation with sulfur at high temperatures. Inclusion bodies of AaSOR were refolded in presence of different non-iron metals to investigate, whether such a redox change is essential for catalysis. Refolded SORs with Fe, Co, Mn or Ni incorporated were biochemically active. EPR spectra of Co- and Mn-containing SORs showed signals for Co2+ and Mn2+ species, respectively. The signal intensities decreased slightly when the enzyme was incubated with sulfur at high temperature, suggesting that small changes occur near the metal center during catalysis, while the metal remained in the same oxidation state. The Co-containing protein was crystallized. Diffraction data did not point to significant structural rearrangements around the metal center. Only a small number of SOR mutants featured a crucial impact on enzyme activity. Therefore, a naturally occurring SOR variant from the mesophilic bacterium Halothiobacillus neapolitanus was analyzed. In this study, the first biochemical and structural characterization of a SOR derived from this mesophilic microorganism is presented (HnSOR). After gene expression in E. coli, the soluble enzyme (HnSOR) was purified and biochemically characterized. The optimal enzyme activity was at pH 8.4 and 80°C. The temperature range of activity covered nearly 90°C. CD spectroscopy showed that HnSOR and AaSOR are similarly folded. Hydrodynamic radii of both proteins were calculated from Dynamic Light Scattering and were nearly identical. The HnSOR structure was determined at 2.9 Å resolution and compared to the AaSOR. Both are structurally similar icosatetrameric proteins. Based on these observations, the sulfur pathway route identified for the AaSOR was applied to the HnSOR. An additional active site exit pore was found, which was so far not identified in the AaSOR but which seems to be present at closer inspection. The active site cavity resembled the situation in the AaSOR including a cysteine persulfide, which was modified without additional heat treatment. The mononuclear iron center is coordinated by three amino acids (H88, H92 and E116) and water molecules in a slightly distorted octahedral geometry. The second coordination sphere does not consist of the E87-homologous residue E89 but of a tyrosine at position 118.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Schwefel-Oxygenase/-Reduktasen (SORs) katalysieren die sauerstoffabhängige Disproportionierung von elementarem Schwefel zu Sulfit, Thiosulfat und Sulfid. Die SOR ist das zentrale schwefel-oxidierende Enzym in dem hyperthermophilen und chemolithoautotrophen Archaeon Acidianus ambivalens. Einzelheiten über den Reaktionsmechanismus sind trotz umfassender biochemischer und struktureller Charakterisierungen noch weitgehend unbekannt. Die Struktur-Funktionsbeziehung der SOR wird in dieser Arbeit mittels zielgerichteter Mutagenese, Metallaustausche im aktiven Zentrum, unterschiedlicher spektroskopischer Methoden und durch Röntgenstrahl-Kristallographie untersucht. Des Weiteren wird erstmalig eine SOR eines mesophilen Mikroorganismus charakterisiert. Als eigentliches Substrat der SOR wurde anstelle eines zyklischen α-S8 Moleküls ein lineares Schwefelmolekül vermutet. Durch einen In-Gel-Enzymaktivitätstest mit der Acidianus ambivalens SOR (AaSOR) konnte gezeigt werden, dass lineares Polysulfid als Substrat genutzt werden kann. In der äußeren Hülle des kugelartigen und hohlen Enzyms befinden sich zwei unterschiedliche Arten von Kanälen, die sich jeweils an den drei- und vierfachen Rotationsachsen befinden und den Substratzugang beziehungsweise den Ausgang der Reaktionsprodukte gewährleisten. Die Poren beider Kanäle wurden mittels zielgerichteter Mutagenese vergrößert. Eine bis um das Vierfache erhöhte Enzymaktivität war die Folge. Zusätzlich änderte sich die zuvor angenommene 1:1 Stöchiometrie von oxidierten und reduzierten Produkten. Eine weitere schmale Pore innerhalb des Proteins ermöglicht den Zugang zum aktiven Zentrum, welches, in einer Tasche liegend, vom inneren Hohlraum abgetrennt ist. Die Porenöffnung wurde ebenfalls mittels Mutagenese vergrößert, was die Enzymaktivität deutlich verminderte. Zn2+ gilt als starker SOR-Inhibitor und wurde im Vorfeld in einem blind endenden Kanal lokalisiert. Die Öffnung des Kanals befindet sich in der Nähe der Eingangspore zum aktiven Zentrum, dennoch ist dieser Kanal vom eigentlichen katalytischen Zentrum weit entfernt. Die erneute Analyse der bereits vorhandenen kristallographischen Daten zeigte, dass zwei Histidin-Reste an der Koordination von Zink beteiligt sind. Im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zeichneten sich Alanin-Mutanten beider Histidine durch dreifach erhöhte Ki-Werte aus. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Histidin-Reste essentiell für die Ligation des Zinks sind. Das aktive Zentrum umfasst ein Cystein-Persulfid und ein mononukleares Eisenzentrum, welches von zwei Histidinen und einem Glutamat koordiniert wird. Die Strukturdaten einer erneut kristallisierten AaSOR wiesen auf ein nicht modifiziertes Cystein an derselben Position hin, das wahrscheinlich mit Hilfe eines hitzeinduzierten Auto-Sulfurierung-Prozesses in ein Cystein-Persulfid überführt wird. Eine wichtige Rolle spielt vermutlich auch ein putatives Wasserstoffbrückennetzwerk im aktiven Zentrum. Hierzu wurden Aminosäuren mutiert, die möglicherweise in Interaktion mit den Eisen-koordinierenden Aminosäuren stehen. Der Großteil dieser konstruierten SOR-Varianten zeichnete sich durch eine leicht verringerte Enzymaktivität aus. Der Austausch eines einzelnen Glutamats (E87), das sich in Wasserstoffbrückendistanz zu einem der Eisen-bindenden Histidine befindet, resultierte jedoch in einer nahezu komplett gehemmten Enzymaktivität. Eine Aspartat-Variante (E87D) mit einer etwas niedrigeren katalytischen Aktivität wurde kristallisiert, und die Analyse der Diffraktionsdaten offenbarte eine nahezu identische Wasserstoffbrückendistanz zwischen dem Aspartat und dem Histidin. Dieses Resultat verdeutlichte die notwendige Interaktion beider Reste. Durch EPR Experimente wurde bereits gezeigt, dass das Eisenzentrum nach Schwefelinkubation bei hohen Temperaturen einen Wechsel des Redoxzustands von Fe3+ zu Fe2+ durchläuft. Einschlusskörperchen der AaSOR wurden in Anwesenheit unterschiedlicher Nichteisenmetalle zurückgefaltet, um zu untersuchen, ob der Redoxwechsel für die katalytische Funktion zwingend erforderlich ist. Zurückgefaltete Fe-, Co-, Mn- oder Ni-haltige SOR Proteine waren biochemisch aktiv. Die EPR Spektren der Co- und Mn-haltigen SOR Proteine zeigten Co2+- beziehungsweise Mn2+-typische Signale. Nach Inkubation mit Schwefel nahmen die Signalintensitäten beider Metalle ab, ohne dass sich deren Redoxzustand änderte, was für minimale Änderungen innerhalb des Metallzentrums spricht. Das Co-haltige Protein wurde kristallisiert, wobei die entsprechenden Strukturdaten keine Hinweise auf signifikante strukturelle Änderungen in der Nähe des Metallzentrums gaben. Da nur eine geringe Anzahl an SOR Mutanten die Enzymaktivität entscheidend beeinflusste, wurde eine natürliche vorkommende SOR-Variante aus dem mesophilen Bakterium Halothiobacillus neapolitanus analysiert. Dies ist die erste biochemische und strukturelle Charakterisierung einer SOR, welche aus einem mesophilen Mikroorganismus stammt (HnSOR). Das lösliche Enzym wurde nach Genexpression in E. coli aufgereinigt und biochemisch untersucht. Die optimale Enzymaktivität lag bei einem pH von 8.4 und einer Temperatur von 80°C, wobei das Enzym über einer Temperaturspanne von nahezu 90°C aktiv war. Durch CD-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass HnSOR und AaSOR eine ähnliche Proteinfaltung aufweisen. Die hydrodynamischen Radien beider Proteine wurden mittels Dynamischer Lichtstreuung berechnet und die Partikelgröße beider Proteine war nahezu identisch. Die Struktur der HnSOR wurde mit einer Auflösung von 2.9 Å bestimmt und mit der Struktur der AaSOR verglichen. Beides sind sehr ähnliche ikosatetramere Proteine und aufgrund dieser Beobachtungen wurde der für die AaSOR formulierte Weg des Schwefels auch für die HnSOR angenommen. Dabei wurde eine zusätzliche Pore in der Nähe des aktiven Zentrums lokalisiert, die bisher noch nicht in der AaSOR identifiziert wurde. Nach genauerer Untersuchung scheint diese aber auch in der AaSOR präsent zu sein. Das aktive Zentrum ähnelt dem katalytischen Zentrum der AaSOR und umfasst ebenfalls ein Cystein-Persulfid, welches ohne zusätzliche Hitzebehandlung modifiziert wurde. Das mononukleare Eisenzentrum ist durch drei Aminosäuren (H88, H92 und E116) und Wassermoleküle in einer leicht verzerrten oktahedralen Geometrie koordiniert. Die zweite Koordinationssphäre besteht allerdings nicht aus dem E87-homologen E89, sondern aus einem Tyrosin an Position 118.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Microbiology & Genetics
Date Deposited: 12 Oct 2011 07:27
Last Modified: 07 Dec 2012 12:01
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-27641
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Kletzin, Dr. habil. Arnulf and Felicitas, Prof. Dr. Pfeifer
Refereed: 16 September 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2764
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