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Hybrid Multimeric Architectures for Enhanced Receptor Targeting and Intracellular Delivery of Bioactive Cargoes

Englert, Simon Peter (2023)
Hybrid Multimeric Architectures for Enhanced Receptor Targeting and Intracellular Delivery of Bioactive Cargoes.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00024493
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Hybrid Multimeric Architectures for Enhanced Receptor Targeting and Intracellular Delivery of Bioactive Cargoes
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Schmitz, Prof. Dr. Katja
Date: 20 September 2023
Place of Publication: Darmstadt
Collation: ix, 275 Seiten
Date of oral examination: 29 March 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00024493
Abstract:

In recent decades, the spectrum of available therapeutics has been expanded by the ever-growing field of biopharmaceuticals such as peptides, proteins, and nucleic acids, which are characterized by advantageous properties including high specificity and potency as a consequence of their molecular structural and functional diversity. However, the application of biotherapeutics is mostly limited to the extracellular environment due to their intrinsic disability to traverse the cellular membrane. In order to overcome this obstacle and expand the range of potential targets for biotherapeutics into the cell´s interior, numerous strategies such as cell-penetrating peptides (CPPs) have been developed. While these cationic peptides facilitate cellular uptake by simple conjugation to the cargo molecule, more sophisticated architectures can be designed to further improve the transduction efficiency. Multimeric presentation of CPPs on scaffold molecules is one of the promising approaches to reach this goal. Analogously, receptor-targeting peptides could also benefit from multimerization on a suited platform.

The presented doctoral thesis summarizes results of a comprehensive study aimed at the development of hybrid multimeric architectures for intracellular delivery of bioactive cargoes and enhancing the performance of receptor-targeting peptides.

The first part of the work addressed the evaluation of various monomeric CPPs, non-peptidic architectures and the CPP L17E, multimerized on the polysaccharide dextran, in their ability to facilitate cellular uptake of bioactive 18mer peptide nucleic acid (PNA) as payload. Thereby, the eGFP654 mis-splicing correction assay was performed as functional assay that allowed for comparison of the delivery modules in a quantitative fashion. Due to the remarkable performance of dextran-L17E hybrids in the mis-splicing assay, the architecture was subjected to further validation in a second functional assay based on the cytosolic delivery of a 16mer peptide. The dextran-L17E approach was able to facilitate cellular uptake of the bioactive peptide, which induced restoration of fluorescence upon complementation to non-functional green fluorescent protein (GFP).

Additionally, dextran-CPP chimeras were assessed in their capabilities to mediate intracellular transport of large payload. In a proof-of-concept study, dextran-CPP hybrids were equipped with biotin and employed as delivery modules for fluorescently labeled streptavidin (Sav) as model cargo. L17E-functionalized dextran was able to facilitate intracellular delivery of the core protein Sav and, furthermore, a biotinylated GFP as additional cargo. However, the impressive performance of efficient protein delivery was accompanied by intolerable cytotoxicity, at least for therapeutic applications.

The first part of this work confirmed the capability of L17E-dextran hybrids as versatile platform for intracellular delivery of relevant payload. Beside PNA and peptides, these architectures could facilitate the cellular uptake of cargo proteins, albeit with significant cytotoxicity. Thus, future investigations could optimize the architecture of dextran-L17E hybrids or replace the peptide by novel, high-performing CPPs.

The second part of this work assessed dextran-Sav hybrids as novel architectures for multimerization of receptor-binding peptides. Dextran equipped with multiple copies of death receptor 5 targeting peptide (DR5TP) was able to efficiently induce apoptosis in a cancer-relevant cell line at low nanomolar concentrations. The apoptotic potency of DR5TP-decorated dextran was distinctly increased upon further multimerization on Sav as centerpiece.

For further evaluation of dextran-Sav architectures as multimerization platform for receptor-targeting peptides, integrin binding cyclic peptides harboring the RGD motif were chosen. While dextran bearing multiple copies of cyclic RGD peptides was able to bind to the isolated target integrin, these results did not translate into a cell-based assay using fluorescently labeled Sav as core protein. Using an antibody fragment (Fc) as dimerization platform for RGD-modified dextran, integrin overexpressing cancer cells could be efficiently targeted and, furthermore, the architecture was suited to deliver a cytotoxic agent into the target cells.

The second part of this work presented dextran-Sav hybrids as promising platform for multimeric receptor-targeting peptides, whereby the scope of successfully-addressable receptors should be the subject of further research. As an alternative, Fc-dextran hybrids remain a highly efficient framework for multimerization of receptor-targeting peptides.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Spektrum der verfügbaren Therapeutika durch das ständig wachsende Feld der Biopharmazeutika erweitert. Im Vergleich zu ihren niedermolekularen Konkurrenten zeichnen sich Biotherapeutika wie Peptide, Proteine und Nukleinsäuren aufgrund ihrer molekularen strukturellen und funktionellen Diversität durch vorteilhafte Eigenschaften wie hohe Spezifität und Potenz aus. Allerdings ist die Anwendung von Biotherapeutika meist auf die extrazelluläre Umgebung beschränkt, da sie die Zellmembran nicht durchdringen können. Um diese Hürde zu überwinden und das Spektrum möglicher Angriffspunkte für Biotherapeutika auf das Zellinnere zu erweitern, wurden zahlreiche Stragien wie zellpenetrierende Peptide (cell-penetrating peptides, CPPs) entwickelt. Während eine erfolgreiche intrazelluläre Verabreichung durch einfache Konjugation dieser kationischen Peptide mit Frachtmolekülen möglich ist, können aufwändigere und ausgefeiltere Architekturen entwickelt werden, um die Transduktionseffizienz weiter zu verbessern. Die Darstellung von multimeren CPPs auf Gerüstmolekülen ist einer der vielversprechenden Ansätze, um dieses Ziel zu erreichen. Analog dazu könnten auch Peptide, die auf Rezeptoren ausgerichtet sind, von der Multimerisierung auf einer geeigneten Plattform profitieren.

Die vorliegende Dissertation fasst die Ergebnisse einer umfassenden Studie zusammen, die auf die Entwicklung hybrider multimerer Architekturen für die intrazelluläre Lieferung von Biomakromolekülen und die Verbesserung der Leistung von Peptiden mit Rezeptortargetierung abzielt.

Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Evaluierung verschiedener CPPs, nicht-peptidischer alternativer Strukturen sowie das CPP L17E, welches auf dem Polysaccharid Dextran multimerisiert wurde, hinsichtlich ihrer Fähigkeiten, die zelluläre Aufnahme von bioaktiver 18mer Peptid-Nukleinsäure (peptide nucleic acid, PNA) als Frachtmolekül zu ermöglichen. Dabei wurde der eGFP654-Fehlsplicing-Korrekturtest als funktioneller Test verwendet, der einen quantitativen Vergleich der Translokationsmodule ermöglichte. Aufgrund der bemerkenswerten Leistung von Dextran-L17E Hybriden im PNA-basierten Test sollte die Architektur in einem zusätzlichen funktionellen Test einer weiteren Validierung unterzogen werden, welche auf der zytosolischen Translokation eines 16mer Peptids basiert. Der Dextran-L17E Ansatz war in der Lage, die zelluläre Aufhnahme des bioaktiven Peptids zu ermöglichen, welche die Wiederherstellung der Fluoreszenz eines nicht-funktionellen grün-fluoreszierenden Proteins (green fluorescent protein, GFP) durch Komplementierung zur Folge hatte.

Desweiteren wurden Dextran-CPP Hybride hinsichtlich ihrer Fähigkeiten zur intrazellulären Lieferung von Biomakromolekülen evaluiert. In einer proof-of-concept Studie wurden CPP-Dextran-Chimären mit Biotin modifiziert und als Transfermodule von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin (Sav) als Modellprotein eingesetzt. L17E-funktionalisiertes Dextran war in der Lage, die intrazellulären Lieferung des Ankerproteins Sav sowie biotin-markiertem GFP als zusätzliche Fracht zu vermitteln. Allerdings ging die eindrucksvolle Leistung der effizienten intrazellulären Proteinlieferung mit einem zumindest für therapeutische Anwendungen nicht tolerierbaren Maß an Toxizität einher.

Der erste Teil der Arbeit bestätigte die Fähigkeit von L17E-Dextran Hybriden als vielseitig einsetzbare Plattform für die intrazelluläre Lieferung relevanter Biomakromoleküle. Neben PNA und Peptiden ermöglichten diese Architekturen auch die zelluläre Aufnahme von Proteinen als Frachtmoleküle, auch wenn dies mit signifikanter Zytotoxizität einherging. Daher könnten zukünftige Untersuchungen entweder die Optimierung von L17E-Dextran Hybriden angehen beziehungsweise das Peptid durch neue, hocheffiziente CPPs ersetzen.

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit untersuchte den Dextran-Sav-Hybridansatz als neue Plattform für die Multimerisierung rezeptorbindender Peptide. Dextran, welches mit mehreren Kopien des death receptor 5 targeting peptide (DR5TP) ausgerüstet war, war in der Lage, Apoptose in krebsrelevanten Zellen im Bereich niedriger nanomolarer Konzentration auszulösen. Die Potenz des mit DR5TP-dekorierten Dextrans konnte noch einmal deutlich erhöht werden, indem es auf dem Ankerprotein Sav multimerisiert wurde.

Für weitere Evaluierung des Dextran-Sav-Hybridansatzes als Multimerisierungsplattform für rezeptorbindende Peptide wurden Integrin-bindende zyklische Peptide ausgewählt, welche das RGD Motiv enthalten. Dextran, ausgestattet mit mehreren Kopien des zyklischen RGD Peptids, war zwar in der Lage, den isolierten Rezeptor zu binden, allerdings übertrug sich dieses Ergebnis nicht auf einen zellbasierten Test mit fluoreszenzmarkiertem Sav als Ankerprotein. Mit Hilfe eines Antikörperfragments (Fc) als Dimerisierungsplattform von RGD-modifiziertem Dextran konnten Integrin-überexprimierende Krebszellen effizient addressiert werden und zudem war das Gebilde in der Lage, ein Zytotoxin in die Zielzellen zu liefern.

Der zweite Teil der Arbeit präsentierte den Dextran-Sav-Hybridansatz als vielversprechende Plattform für rezeptorbindende Peptide, wobei das Spektrum von erfolgreich-addressierbaren Rezeptoren in weiteren Studien untersucht werden sollte. Als Alternative verbleiben Fc-Dextran Hybride als hocheffizientes Gerüst für die Multimerisierung rezeptorbindender Peptide.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-244930
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 20 Sep 2023 12:50
Last Modified: 27 Sep 2023 08:29
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/24493
PPN: 511904592
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