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DNA breaks regulate neuronal activity: NMDA-receptor and ionizing radiation-mediated DNA double-strand breaks govern activity regulating early-response gene expression

Kaur, Rajvinder (2021):
DNA breaks regulate neuronal activity: NMDA-receptor and ionizing radiation-mediated DNA double-strand breaks govern activity regulating early-response gene expression. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00019655,
[Ph.D. Thesis]

Rajvinder kaur_Ph.D dissertation_Laube lab_Submission version_21092021.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: DNA breaks regulate neuronal activity: NMDA-receptor and ionizing radiation-mediated DNA double-strand breaks govern activity regulating early-response gene expression
Language: English

DNA (Deoxyribonucleic acid) double-strand breaks (DSBs) are the hazardous form of DNA damage endured on multiple occasions by both proliferating and post-mitotic cells. Unlike replicating cells, which can employ sister chromatids as a repair template, post-mitotic cells such as adult neurons could suffer lethal effects from error-prone repair of non-homologous end-joining (NHEJ) machinery. Hence, until recently, DSBs were considered only the results of pathological activity in post-mitotic cells. However, recent shreds of evidence also show the presence of neuronal activity-induced and type 2 topoisomerase beta (Top2β) generated transient physiological DSBs, which regulate the expression of multi-functional early response or immediate early genes (IEGs). Till yet, these DSBs driven gene regulations have only been studied in cortical cultures. Among many, one of the functions of effectors IEGs is the regulation of neuronal activity by activation of secondary response genes. Therefore, hypothesizing that neuronal activity induced DSB promotes certain IEGs expression and further these genes could regulate the activity, we aimed to, i) first validate the correlation of neuronal activity generated DSBs with IEGs expression in neuronal model systems other than cortical cultures ii) investigate the effects of altering DNA DSB's status on neuronal network activity. As a model system for our analysis, we employed 14 days-in-vitro (DIV) mice hippocampal cultures (HCs), where the expression of IEGs has been reported before. As only specific neuronal activity could lead to induction of physiological DSBs, we primarily focused on the DNA breaks generated by N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) dependent cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) response element-binding protein (CREB) activity. For our investigation, we employed a combination of Microelectrode arrays recordings (MEA) for neuronal network activity measurements, Gamma-H2AX staining to monitor DSBs' presence and messenger Ribonucleic acid (mRNA) and protein analysis for IEGs expression. Following NMDAR activation, we detected an increase in DSBs status, which correlated with the expression of IEGs- c-Fos, Egr1 and c-Jun and upregulation in neuronal activity. Additionally, the DSBs status and IEGs expression were also analyzed following the inhibition of essential synaptic plasticity-associated components, CREB and the GluN2B subunit of the NMDAR. Our results showed that the deficiency in any of these factors leads to a decrease in certain IEGs expression, likely by causing changes in DSBs status. Further, to investigate if DSBs status alteration can affect neuronal firing activity by perturbating IEGs expression, we incubated HCs with either etoposide, a chemotherapeutic agent that generates DSBs on the site of Top2β activity, Top2β (small interfering RNA) siRNA and NHEJ inhibitor (NU7441). Our data discovered that a perturbation in either the induction and repair of the DSBs following NMDAR activation contributes to both altered IEGs expression and neuronal activity. Furthermore, the IEGs expression was also monitored in the Severe combined immunodeficiency (SCID) mice model. Our novel results revealed that these mice models have a low level of IEGs expression, most likely due to the inherent deficiency in the components of NHEJ. This could lead to severe learning and memory problems that these mice possess. Thus, our study provides experimental evidence on the role of synaptic NMDARs mediated DSBs in mediating IEGs expression and further how a perturbation in the DSBs induction and repair could contribute to an altered pattern of neuronal activity in HCs. Furthermore, by assessing these connective links of receptor activity with gene expression and neuronal recordings, our study validates the multi-purpose use of such an in-vitro model to elucidate changes in cellular and electrophysiological levels. In the second part of this work, we investigated the effect of low-dose radiation exposure on IEGs expression. Ionizing radiation (IR) is an effective treatment for various tumors infested in the central nervous system (CNS). Proceeding the clinical trials, multiple literature pieces have shown how even low dose exposure could alter synaptic plasticity, a basis for cognitive functioning. However, it becomes complicated to assess the connective link between irradiation and synaptic plasticity-associated components due to IR's multi targets. Therefore, to understand how irradiation can have a lethal effect on cognitive domains, we focussed on the expression of the genes that are easily activated by various stimuli and play a role in learning and memory acquisition. For this, we studied the effect of low to moderate IR doses on the expression of IEGs in 14 DIV HCs. Results of immunostaining against Gamma-H2AX following radiation exposure revealed that a single 2 Gy dose generates many DSBs in the post-mitotic neuron post-60-minute (min) exposure. However, the expression of IEGs such as c-Fos and Egr1 as assessed by mRNA and protein analysis following the same dose radiation exposure is downregulated. As both of these genes are the regulator of neuronal activity, we next analyzed the neuronal network activity following irradiation. Our data revealed that a single dose of 2 Gy is sufficient to cause a decrease in neuronal network activity after 60 min of exposure. NMDAR plays a vital role in IEGs expression; therefore, we investigated if NMDA incubation can counteract the radiation alleviated IEGs expression level. Consequently, we further investigated the simultaneous impact of NMDAR activation and irradiation on the control of IEGs expression by DSB's and mRNA analysis. Our results revealed that 60 min of continuous NMDA treatment counteracts radiation-induced alleviation of IEGs expression. These findings are the first to reveal changes in IEGs expression and neuronal activity in HCs following 1-hour post- single-irradiation events. Further, it hints towards the interaction radiation has with the NMDAR pathway for the gene expression changes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

DNA ("Deoxyribonucleic acid")-Doppelstrangbrüche (DSB) sind eine gefährliche Form von DNASchäden, die sowohl proliferierende als auch post-mitotische Zellen erleiden können. Im Gegensatz zu proliferierenden Zellen, die Schwesterchromatiden als Reparaturvorlage verwenden können, postmitotische Zellen, wie z.B. adulte Neuronen, können durch die fehleranfällige Reparatur der "nonhomologous end-joining" (NHEJ) tödliche Wirkungen erleiden. Daher wurden DSB bis vor kurzem nur als Ergebnis einer pathologischen Aktivität in postmitotischen Zellen angesehen. Jedoch deuten kürzlich veröffentlicht Studien auf einen Zusammenhang von durch neuronale Aktivität induzierte und durch Typ-2-Topoisomerase beta (Top2β) erzeugte transiente physiologische DSB, welche die Expression von multifunktionalen "early response"- oder "immediate early genes" (IEGs) regulieren. Bisher wurde diese DSB-gesteuerte Genregulation nur in kortikalen Kulturen untersucht. Eine der vielen Funktionen der IEGs ist die Regulation der neuronalen Aktivität durch die Aktivierung von Sekundärantwortgenen. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass neuronale Aktivität induzierte DSBs die Expression bestimmter IEGs fördert und dass diese Gene die Aktivität regulieren könnten. Unser Ziel war es, i) zunächst die Korrelation von neuronaler Aktivität, die DSB erzeugt, mit der Expression von IEGs in anderen neuronalen Modellsystemen als kortikalen Kulturen zu validieren und ii) die Auswirkungen der Veränderung des DNA-DSB-Status auf die neuronale Netzwerkaktivität zu untersuchen. Als Modellsystem für unsere Analyse verwendeten wir 14 "Days-in-vitro" (DIV) Mäuse-"hippocampal cultures" (HCs), in denen bereits über die Expression von IEGs berichtet worden war. Da nur spezifische neuronale Aktivität zur Induktion physiologischer DSBs führen kann, konzentrierten wir uns primär auf die DNA-Brüche, die durch "N-Methyl-D-Aspartate-Receptors" (NMDARs) abhängige "cAMP ("Cyclic adenosine monophosphate") response element-binding protein" (CREB) Aktivität erzeugt werden. Für unsere Untersuchung verwendeten wir eine Kombination aus "Microelectrode-Array"- Aufnahmen (MEA) zur Messung der neuronalen Netzwerkaktivität, Gamma-H2AX-Färbungen zur Überwachung des Vorhandenseins von DSB und "messanger Ribonucleic acid" (mRNA) und ProteinAnalyse für die IEGs-Expression. Nach NMDAR-Aktivierung wurde ein Anstieg des DSB-Status festgestellt, der mit der Expression von IEGs- c-Fos, Egr1 und c-Jun - und einer Hochregulierung der neuronalen Aktivität korrelierte. Zusätzlich wurde der DSB-Status und die IEGs-Expression auch nach der Hemmung von essentiellen, mit synaptischer Plastizität assoziierte Komponenten, CREB und die GluN2B-Untereinheit des NMDAR, analysiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Mangel an einem dieser Faktoren zu einer Abnahme der Expression bestimmter IEGs führt, wahrscheinlich durch Veränderungen im DSB-Status. Um weiter zu untersuchen, ob eine Veränderung des DSB-Status die neuronale Feuerungsaktivität durch eine Störung der IEGs-Expression beeinflussen kann, inkubierten wir HCs entweder mit Etoposid, einem Chemotherapeutikum, das DSBs an den Stellen Top2β-Aktivität, Top2β (small interfering RNA) siRNA und NHEJ-Inhibitor (NU7441) erzeugt. Unsere Daten entdeckten, dass eine Störung in der Induktion und Reparatur der DSB nach NMDAR-Aktivierung sowohl zu einer veränderten IEGs-Expression als auch zu einer veränderten neuronalen Aktivität beiträgt. Darüber hinaus wurde die IEGs Expression auch im Mäusemodell der "Severe combined immunodeficiency" (SCID) überwacht. Unsere neuen Ergebnisse zeigten, dass diese Mäusemodelle eine niedrige IEGs-Expression aufweisen, was höchstwahrscheinlich auf den inhärenten Mangel an den Komponenten von NHEJ zurückzuführen ist. Dies könnte zu schweren Lern- und Gedächtnisdefiziten führen, welche diese Mäuse haben. Somit liefert unsere Studie experimentelle Beweise für die Rolle der durch synaptische NMDARs vermittelten DSB bei der Vermittlung der IEGs-Expression und zeigt darüber hinaus, wie eine Störung der DSB-Induktion und -Reparatur zu einem veränderten Muster der neuronalen Aktivität in HCs beitragen könnte. Indem wir diese Zusammenhänge der Rezeptoraktivität mit der Genexpression und den neuronalen Ableitungen untersuchen, validiert unsere Studie außerdem die vielseitige Verwendung eines solchen In-vitro-Modells zur Aufklärung von Veränderungen auf zellulärer und elektrophysiologischer Ebene. Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten wir die Auswirkung von Strahlenbelastung auf die Expression von IEGs. Ionisierende Strahlung (IS) ist eine wirksame Behandlung für verschiedene Tumore, die das zentrale Nervensystem (ZNS) befallen. Im Anschluss an die klinischen Studien wurde in der Literatur mehrfach gezeigt, wie selbst eine niedrige Dosis die synaptische Plastizität, eine Grundlage für kognitive Funktionen, verändern kann. Allerdings wird es aufgrund der vielen Angriffspunkte der IS kompliziert, den Zusammenhang zwischen der Bestrahlung und den Komponenten der synaptischen Plastizität zu beurteilen. Um zu verstehen, wie eine Bestrahlung eine tödliche Wirkung auf kognitive Bereiche haben kann, konzentrierten wir uns auf die Expression der Gene, die leicht durch verschiedene Reize aktiviert werden und eine Rolle beim Lernen und Gedächtniserwerb spielen. Dazu untersuchten wir den Effekt einer niedrigen bis moderaten IS-Dosis auf die Expression von IEGs in 14 DIV HCs. Die Ergebnisse der Immunfärbung gegen Gamma-H2AX nach Strahlenexposition zeigten, dass eine einzelne 2 Gy-Dosis viele DSB post-mitotischen Neuron 60 Minuten (min) nach der Exposition erzeugt. Allerdings ist die Expression von IEGs wie c-Fos und Egr1, wie durch mRNA- und Protein-Analyse ermittelt, nach der gleichen IS Dosis herunterreguliert. Da diese beiden Gene die neuronale Aktivität regulieren, analysierten wir als nächstes die neuronale Netzwerkaktivität nach der Bestrahlung. Unsere Daten zeigten, dass eine Einzeldosis von 2 Gy ausreicht, um eine Abnahme der neuronalen Netzwerkaktivität 60 min nach der Bestrahlung zu verursachen. NMDAR spielt eine wichtige Rolle bei der IEGs-Expression; daher untersuchten wir, ob die NMDA-Inkubation dem durch die Strahlung verminderten IEGs-Expressionsniveau entgegenwirken kann. Folglich untersuchten wir weiter den gleichzeitigen Einfluss von NMDAR-Aktivierung und Bestrahlung auf die Kontrolle der IEGsExpression durch DSB und mRNA-Analyse. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine 60-minütige kontinuierliche NMDA-Behandlung der strahleninduzierten Verminderung der IEGs-Expression entgegenwirkt. Diese Ergebnisse sind die ersten, die Veränderungen in der IEGs-Expression und der neuronalen Aktivität in HCs nach 1-stündigen einzelnen Bestrahlungsereignissen aufzeigen. Außerdem weisen sie auf die Interaktion der Strahlung mit dem NMDAR-Signalweg hin, die für die Veränderungen der Genexpression verantwortlich ist.

Place of Publication: Darmstadt
Collation: 77 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
Date Deposited: 09 Nov 2021 14:06
Last Modified: 09 Nov 2021 14:06
DOI: 10.26083/tuprints-00019655
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-196556
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo ; Loewer, Prof. Dr. Alexander
Refereed: 9 September 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19655
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