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RNA editing in African trypanosomes requires a 3' nucleotidyl phosphatase - the biochemical consequences of the exoUase activity of TbMP42

Niemann, Moritz :
RNA editing in African trypanosomes requires a 3' nucleotidyl phosphatase - the biochemical consequences of the exoUase activity of TbMP42.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2008)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: RNA editing in African trypanosomes requires a 3' nucleotidyl phosphatase - the biochemical consequences of the exoUase activity of TbMP42
Language: English
Abstract:

Mitochondrial transcripts in African trypanosomes are post-transcriptionally modified by a process known as RNA editing. The reaction transforms cryptic pre-mRNAs into functional mRNAs and is characterized by the insertion and deletion of exclusively uridylyl residues. RNA editing is catalyzed by subcellular machines, so called editosomes. Editosomes are protein complexes consisting of ~20 polypeptides. In addition, the process relies on small, non-coding RNAs termed guide (g) RNAs. gRNAs are trans-acting molecular components, which specify the insertion and deletion events via basepairing. TbMP42 (Trypansoma brucei mitochondrial protein, MW: 42kDa) is an integral protein of the editosomal machinery. Chapter one and two of the thesis describe the endo/exoribonuclease activity of TbMP42 and characterize the reaction pathway that leads to pre-mRNA substrate cleavage. Experiments using recombinant (r) protein show that TbMP42 is a topology-dependent ribonuclease that is sensitive to base-stacking. The protein has a preference for single stranded uridylyl residues and the ribonuclease activity depends on Zn2+-ions and Zn2+-coordinating amino acids within the oligonucleotide/oligosaccharide binding site (OB-fold) at the C-terminus of the protein. RNAi-mediated gene silencing of TbMP42 is lethal for T. brucei and results in reduced endo/exoribonuclease and RNA editing activities in vitro. However, all three activities can be restored by the addition of rTbMP42. Chapter three addresses the biochemical consequences of the in vitro exoribonuclease activity of TbMP42 and its implication for the editing cycle. The data suggest that RNA editing includes an additional enzymatic reaction step that is conducted by a 3’-specific nucleotidyl phosphatase. Evidence is presented that the nucleotidyl phosphatase activity is part of the editosome and that it is mediated by two editosomal protein components: TbMP99 and TbMP100. Both polypeptides have endo-exo-phosphatase (EEP) domains and the simultaneous knockdown of the two proteins results in a reduction of the phosphatase activity in vitro. A final chapter deals with the identification of novel gRNAs, including gRNAs that potentially direct “alternative” editing events. “Alternative” RNA editing is a source for the generation of protein diversity within T. brucei mitochondria and thus, provides an additional regulatory layer for the editing machinery.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Mitochondriale Transkripte in afrikanischen Trypanosomen durchlaufen eine als RNA-Editing bezeichnete posttranskriptionelle Modifizierungsreaktion. Der Prozess ist durch die Insertion und/oder Deletion von ausschließlich Uridylatresten in kryptische prä-mRNAs charakterisiert und transformiert diese zu funktionalen, translatierbaren mRNAs. Die Reaktion wird durch hochmolekulare, subzelluläre Maschinen katalysiert, sogenannte Editosomen. Editosomen sind Proteinkomplexe, die aus ca. 20 Komponenten bestehen und mit kleinen, nicht kodierenden RNA-Molekülen wechselwirken. Diese RNAs spezifizieren die Insertions- und Deletionsereignisse als trans-agierende Faktoren und werden guide RNAs genannt. TbMP42 (Trypansoma brucei mitochondrial protein, MW: 42kDa) ist ein integraler Bestandteil der editosomalen Maschinerie und in der vorliegenden Arbeit wird die Endo/Exoribonukleaseaktiviät des Polypeptides beschrieben sowie sein Reaktionsmechanismus untersucht. Versuche mit rekombinantem TbMP42 zeigten, dass es sich um eine struktursensitive Ribonuklease handelt, die in der Lage ist, base stacking zu erkennen und eine Präferenz für einzelsträngige Uridylatreste zeigt. Die Ribonuklease-Aktivität von TbMP42 ist Zn2+-Ionen abhängig und lokalisert im C-terminalen Bereich des Proteins, der eine Oligonukleotid/Oligosaccharid-Bindedomäne (OB-Fold) enthält. RNAi-vermitteltes gene silencing von TbMP42 induziert Letalität in T. brucei sowie eine Reduktion der Endo/Exoribonuklease und RNA-Editing Aktiviät in vitro. Alle drei Aktivitäten können jedoch durch rekombinantes TbMP42 komplementiert werden. Die 3’-5’ uridylatspezifische Exoribonukleaseaktivität (exoUase) von TbMP42 generiert 3’ Nukleosidmonophosphate. Hieraus ergibt sich als biochemische Konsequenz die Beteiligung einer 3’ spezifischen Nukleotidyl-Phosphataseaktivität am RNA-Editingzyklus. Eine solche Aktivität ist in mitochondrialen Extrakten nachweisbar und assoziiert mit editosomalen Komponenten. Die Charakterisierung der 3’ spezifischen Phosphatase-Aktivität deutet auf die Beteiligung von zwei Proteinen hin: TbMP99 und TbMP100. Beide Polypeptide besitzen eine Endo-Exo-Phosphatase (EEP) Konsensus-Sequenz, RNAi-vermitteltes gene silencing von TbMP99 oder TbMP100 hat allerdings keinen Einfluss auf die in vitro Phosphataseaktivität. Der simultane knockdown von beiden Proteinen hingegen zeigt eine Reduktion in der Phosphataseaktivität in vitro. Das deuted darauf hin, dass zumindest eines der beiden Proteine Phosphataseaktivität besitzt. Obwohl die RNA Editing Maschinerie sehr komplex aufgebaut ist und eine Notwendigkeit für korrekt edititerte Transkripte besteht, ist die Reaktion nicht auf Präzision hin optimiert. In vivo Studien zeigen, dass im steady state ein hohes Mass an mis-editierten Transkripten existiert. Tatsächlich finden sich eine Reihe von guide RNAs, die „alternative“ Editing-Ereignisse dirigieren. Eine mögliche Erklärung ist, dass dieses „alternative“ Editing eine Quelle für Proteindiversität darstellt. In diesem Teilaspekt der Arbeit wird der Versuch beschrieben, zusätzliche gRNAs zu identifizieren und alternative Editing-Prozesse nachzuweisen.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:23
Last Modified: 07 Dec 2012 11:54
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-10611
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 1 July 2008
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1061
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