Die scherstressabhängige Regulation der Thrombospondin-1 Expression

Vaskuläre Endothelzellen bilden in vivo als innerste Zellschicht von Blutgefäßen eine mechanische Barriere zwischen der Gefäßwand und dem strömenden Blut aus. Aufgrund ihrer exponierten Lage sind sie direkt unterschiedlichen Kräften ausgesetzt. Neben der durch den Blutfluss verursachten laminaren Strömung wirken weitere, gerichtete mechanische Reize wie der rhythmische Wechsel des Gefäßdurchmessers durch Herz- oder Pulsschlag auf das Endothel ein. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Apoptose vaskulärer Endothelzellen strömungsabhängig durch eine autokrine Schleife reguliert wird, die aus dem Rezeptorkomplex Integrin vß3 und CD47 sowie dem Liganden Thrombospondin-1 (Tsp-1) besteht. Während das Integrin unabhängig von äußeren Strömungseinwirkungen konstitutiv exprimiert wird, konnte für das CD47 gezeigt werden, dass es zwar unter statischen und dynamischen Bedingungen vorhanden ist, aber strömungsabhängig eine Konformationsänderung erfährt, die die Bildung eines aktiven Komplexes verhindert. Ferner konnte in vorangegangenen Studien gezeigt werden, dass die Tsp-1 Konzentration im Kulturüberstand statisch kultivierter HUVEC mit zunehmender Kultivierungsdauer ansteigt, im Kulturüberstand dynamisch kultivierter Zellen dagegen konstant auf einem niedrigen Niveau bleibt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation der mechanosensitiven Apoptose makrovaskulärer Endothelzellen näher charakterisiert, indem die strömungsabhängige Expression des Tsp-1 auf Protein- und RNS-Ebene genauer untersucht wurde. Hierzu wurden HUVEC unter laminaren Bedingungen in einer Plattenkegelscherungsapparatur dynamisch kultiviert und mit ihren jeweiligen statischen Kontrollen hinsichtlich der Expression des Tsp-1 verglichen. Durch radioaktive metabolische Markierungsexperimente konnte gezeigt werden, dass im Kulturüberstand und im Zelllysat dynamisch kultivierter Zellen nur ca. 15 % der Tsp-1 Proteinmenge statisch kultivierter Zellen vorhanden war. Ein Vergleich der Tsp-1 mRNS Mengen unter statischen und dynamischen Bedingungen legte nahe, dass die Regulation der Tsp-1 Expression auf RNS-Ebene stattfand. Unter einen Scherstress von 10 dyn/cm2 waren nur ca. 35 % der Tsp-1 mRNS vorhanden. Eine computergestütze Analyse der 2971 bp großen Tsp-1 Promotorregion von der Position -2217 bis +754, bezogen auf den Transkriptionsstartpunkt, auf Sequenzhomologien zu bekannten Transkriptionsfaktor-bindestellen zeigte einige Bindungsstellen für Faktoren, die bereits im Zusammenhang mit scherstressabhängiger Genregulation beschrieben wurden. Von besonderem Interesse war hierbei die Transkriptionsfaktorbindestelle an der Position -1123 die als Shear Stress Response Element (SSRE) bereits in anderen scherstressabhängig regulierten Promotoren beschrieben wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die scherstressabhängige Regulation des Tsp-1 Promotor durch unterschiedliche Promotortestplasmide charakterisiert. Diese enthielten unterschiedliche 5-Deletionen sowie Deletionen im Bereich des ersten Introns und der 5-UTR. Außerdem wurde die Sequenz des SSRE mutiert. Die Vektoren wurden stabil in die Zelllinie BHK-21 transfiziert und die Expressionsraten der Promotortestplasmide unter statischen und dynamischen Bedingungen untersucht. Hierbei konnte eine scherstressabhängige Regulation des Tsp-1 Promotors bestätigt werden, die jedoch durch Veränderungen des SSRE entweder durch zunehmende 5`-Deletion oder durch Mutationen unterbunden wurde. Außer dem SSRE schien weiterhin eine Egr-1 Bindestelle im ersten Intron des Tsp-1 Gens an dessen scherstressabhängiger Regulation beteiligt zu sein.

The shear stress dependent regulation of the expression of Thrombospondin-1 Vascular endothelial cells form the inner wall of blood vessels and are thus subjected to different mechanical forces, the most important of which are hydrostatic pressure, rhythmical stretching and relaxation through the vascular tone and shear stress which is generated by the blood flowing through the vessel. Earlier studies show that flow dependent apoptosis of vascular endothelial cells is regulated by an autocrine loop of integrin vß3 and CD47 as a receptor complex and Thrombospondin-1 (Tsp-1) as its ligand. Integrin and CD47 are constantly expressed under static and dynamic conditions, but CD47 seems to undergo conformational changes under dynamic conditions so that the receptor complex remains inactive. ELISA studies revealed that the concentration of Tsp-1 rises with time in the supernatant of cells cultivated in static conditions, but remains low if cells are cultivated in dynamic conditions. In this study the protein and RNA expression levels of Tsp-1 were measured under static and dynamic conditions. Radioactive metabolic labeling experiments revealed only 15 % Tsp-1 in the supernatant and cell lysates of dynamically cultivated cells compared to static conditions. Northern blot analysis showed that the flow dependent expression of Tsp-1 is regulated at transcriptional levels. A transcription factor analysis of the Tsp-1 promotor region from –2217 to +754 revealed several potential binding sites for shear stress sensitive transcription factors: for example a shear stress response element (SSRE) at position –1123. Several reporter vectors were constructed to measure the shear stress dependent regulation of the Tsp-1 promotor. The reporter vectors were stably transfected into BHK-21 cells and the expression rates of the SEAP-reportergene were measured under static and dynamic conditions. Deletion or mutation of the SSRE neutralised the shear stress responsiveness of the Tsp-1 promotor, but the same effect was observed after deletion of a potential Egr-1 binding site within the first intron of the Tsp-1 gene. These data suggest an active role of a SSRE and a Egr-1 transcription factor binding site in the shear stress dependent regulation of the Tsp-1 gene.