Auto- and cross-regulation of the hnRNPs D and DL & Hypoxia-driven gene expression changes in human cancer cells

RNA-binding proteins (RBPs) control all steps of mRNA processing, including pre-mRNA splicing, mRNA localization, stability and translation efficiency. Auto- and cross-regulation of RBPs is essential for RBP homeostasis and the prevention of pathologies. Consequently, deregulation of RBPs is prevalent in diseases, in particular during tumorigenesis. A profound understanding of RBP regulation is thus indispensible to open up new approaches in cancer therapy. HnRNP DL is a ubiquitous RBP that is overexpressed in prostate cancer and chronic myeloid leukemia. HnRNP DL was suggested to regulate its own expression in a negative feedback loop via usage of a poison exon in its 3’ UTR. In this study, hnRNP DL autoregulation by binding to its own pre-mRNA was confirmed and cross-regulation between hnRNP DL and its well-studied paralog hnRNP D (AUF1) was demonstrated. Strikingly, hnRNP DL is a crucial factor for endothelial cell function, such as migration and angiogenesis. This highlights the influence of hnRNP DL, and RBPs in general, on cellular key processes. The cellular environment has an influence on the levels of RBPs and their functionality. Oxygen starvation (hypoxia) is a common cellular stress. It appears physiologically at high altitudes or during embryonic development, but hypoxia is also typical for diseased tissue. In particular in solid tumors, the hypoxic microenvironment influences gene expression and promotes cancerogenesis leading to poor patient outcomes. The transcriptional response to hypoxia is well studied and controlled by hypoxia inducible factor (HIF) proteins. However, the posttrancriptional response to hypoxia is still poorly understood. Thus, this study focused on hypoxia-driven changes in RBP levels and alternative splicing (AS) in human cancer cells. Transcriptome analyses showed correlated gene expression changes in human lung and breast cancer cells after chronic hypoxia treatment, but AS changes were highly divergent, demonstrating the cell type-specificity of AS. Strikingly, muscleblind-like 2 (MBNL2) was specifically induced under hypoxia, while RBPs were predominantly reduced. Subsequent transcriptome analyses after MBNL2 depletion showed that MBNL2 controls hypoxia-driven AS and the transcript abundance of typical hypoxia-induced genes, such as vascular endothelial growth factor (VEGFA). Strikingly, this control is specific for MBNL2 and not shared by its paralog MBNL1, showing the importance of MBNL2 for cancer cell adaptation to hypoxia. In addition, MBNL2 depletion led to reduced cancer cell proliferation and migration, indicating that deregulated RBPs might be new targets for cancer therapy.

RNA-Bindeproteine (RBPs) regulieren alle Schritte der mRNA Prozessierung. Typisch für RBPs ist, dass sie sich selbst (Autoregulation) oder gegenseitig (Crossregulation) regulieren, was wichtig für die RBP Homöostase ist. Entsprechend sind RBPs in vielen Krankheitsbildern dereguliert, u.a. bei Krebserkrankungen. Das Verständnis der RBP Regulation ist daher wichtig, um neue Ansatzpunkte für Therapien zu liefern. HnRNP DL ist ein ubiquitäres RBP, welches bei Prostatakrebs und chronischer myeloischer Leukämie überexprimiert wird. HnRNP DL reguliert seine eigene Expression durch eine negative Rückkopplungsschleife, durch Inklusion eines sogenannten „poison“ Exons. In dieser Arbeit wurde die Autoregulation von hnRNP DL durch die direkte Bindung der eigenen prä-mRNA bestätigt. Außerdem konnte die Crossregulation zwischen hnRNP D und DL gezeigt werden. Es ist bemerkenswert, dass hnRNP DL maßgebend für endotheliale Funktionen wie Migration und Angiogenese ist. Dies unterstreicht die Rolle von hnRNP DL, und RBPs im Allgemeinen, bei wichtigen zellulären Prozessen. Sauerstoffmangel (Hypoxie) ist ein häufig auftretender Stressfaktor und tritt in großen Höhen oder bei der Embryonalentwicklung auf. Sie spielt aber auch eine Rolle bei vielen Krankheiten. Typisch ist Hypoxie für solide Tumore, in welchen sie die Genexpression beeinflusst und so schwere Krankheitsverläufe begünstigt. Sogenannte hypoxia inducible factor (HIF) Proteine vermitteln die transkriptionelle Antwort auf Hypoxie. Diese ist bereits gut untersucht, während über die post-transkriptionelle Regulation unter Hypoxie noch sehr wenig bekannt ist. Deshalb beschäftigte sich diese Arbeit mit dem Einfluss von Hypoxie auf RBPs und auf das alternative Spleißen (AS). Transkriptomanalysen nach chronischer Hypoxiebehandlung zeigten korrelierte Genexpressionsänderungen in humanen Lungen- und Brustkrebszellen, AS-Änderungen waren jedoch sehr unterschiedlich. Auffallend war, dass Muscleblind-like 2 (MBNL2) spezifisch unter Hypoxie induziert wurde, während andere RBPs hauptsächlich reduziert waren. Nachfolgende Transkriptomanalysen nach MBNL2-Knockdown zeigten, dass MBNL2 hypoxie-abhängiges AS und die Transkripthäufigkeit typischer hypoxie-induzierter Gene, wie beispielsweise VEGFA, kontrolliert. Diese Kontrolle ist spezifisch für MBNL2 und wird nicht von seinem Paralog MBNL1 ausgeübt, was die Bedeutung von MBNL2 für die Anpassung von Krebszellen an Hypoxie verdeutlicht. Darüber hinaus führte die Reduktion von MBNL2 zu einer reduzierten Krebszell-Proliferation und -Migration, was darauf hindeutet, dass deregulierte RBPs neue Ziele für die Krebstherapie sein könnten.