Differentielle Proteomanalyse porciner Hirnkapillarendothelzellen

Das cerebrale Kapillarendothel stellt die anatomische Basis für den Stofftransport zwischen Blut und Gehirn dar. Diese als Blut-Hirn-Schranke bezeichnete Barriere schützt das Gehirn vor metabolischen Schwankungen der Blutzusammensetzung und vor dem Eindringen neurotoxischer Substanzen. Gleichzeitig erfolgt über die Blut-Hirn-Schranke der Austausch von Nährstoffen, Ionen und Metaboliten zwischen Blut und Gehirn. Die funktionellen Besonderheiten der Blut-Hirn-Schranke spiegeln sich in der Proteinausstattung der Hirnkapillarendothelzellen - ihrem Proteom - wieder. Zum Verständnis der Schrankenfunktion ist daher die Identifizierung von Proteinen notwendig, die spezifisch in Hirnkapillaren exprimiert werden (differentielle Proteomanalyse). Eine Methode zur Darstellung von Proteomen ist die 2-D Gelelektrophorese. Dabei erfolgt die Separierung in der ersten Dimension durch isoelektrische Fokussierung aufgrund der Ladung der Proteine. Als zweite Dimension schließt sich senkrecht dazu eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese an, welche die Proteine nach ihrem Molekulargewicht trennt. Nach Trennung im 2-D Gel erfolgt die Identifizierung der Proteinspots mit Hilfe der Massenspektrometrie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Proteomanalyse porciner Hirnkapillarendothelzellen durchgeführt. Die Zellen wurden aus schlachtfrischen Schweinehirnen präpariert. Die Präparationsschritte wurden dabei optimiert, so dass Zellmaterial mit der für die Proteomanalyse notwendigen hohen Vitalität und Reinheit erhalten wurde. Zum fraktionierenden Aufschluß der Zellen wurde ein Verfahren etabliert, das im wesentlichen aus der sequentiellen Extraktion des Probenmaterials mit verschiedenen detergenzhaltigen Puffern bestand. In den dabei erhaltenen Proteinfraktionen waren cytosolische Proteine, Membranproteine und Kernproteine angereichert. Mittels MALDI-Analyse wurden zunächst 45 Proteine aus der Membranfraktion und 23 Proteine aus der Kernfraktion identifiziert. Für die Detektion von Blut-Hirn-Schranke-spezifischen Proteinen, wurden die Proteinmuster der 2-D Gele aus Hirnkapillarendothelzellen mit denen aus Aortaendothelzellen, die keine Schrankenfunktion besitzen, verglichen. Insgesamt wurden 11 Proteine identifiziert, die in Hirnkapillarendothelzellen nicht aber in Aortaendothelzellen exprimiert werden. 3 der identifizierten Proteine wurden in Hirnkapillarendothelzellen mindestens zweimal stärker exprimiert. Unter den differentiell exprimierten Proteinen war eine bisher nicht beschriebene Isoform der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Kinase a (aCamKII). Das Protein ist neben dem CamKII-assoziierten Protein a-KAP die einzige bisher beschrieben Isoform, die keine Kinaseaktivität aufweist und wird wahrscheinlich gehirnspezifisch exprimiert. Der wesentliche Unterschied zu a-KAP ist das Fehlen einer 11 AS-Sequenz, die ein potentielles Kernlokalisierungssignal enthält. Das Protein spielt vermutlich ebenso wie a-KAP eine Rolle beim intrazellulären Targeting der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Kinase und hätte damit eine indirekte Funktion bei der Weiterleitung zahlreicher extrazellulärer Signale.

The cerebrale microvessel endothelium represents the anatomical basis for the transfer of substances between blood and brain. This so called blood-brain barrier protects the brain against metabolic fluctuations of the blood composition and against penetration of neurotoxic substances. At the same time the exchange of nutrients, ions and metabolites between blood and brain takes place through the blood-brain barrier. The functional characteristics of the blood-brain barrier are reflected in the protein equipment of the brain microvessel endothelial cells - its Proteom. In order to understand the barrier function, it is necessary to identify the proteins, which are specifically expressed in brain microvessels. A method for the representation of a proteome is the 2-D gel electrophoresis. The separation takes place in the first dimension via isoelectric focusing according to the charge of the proteins. As the second dimension a SDS-PAGE follows which separates the proteins according to their molecular weight. After separation in the 2-D gel the identification of the proteins is done by means of mass spectrometry. In the context of this work the differential proteomic analysis of porcine brain microvessel endothelial cells was performed. The cell preparation process has been optimized so that cell material with high vitality and purity necessary for the proteomic analysis could be obtained. For the fractionation of the cells a procedure was established, which essentially consisted of the sequential extraction of the sample material using different detergent containing buffers. The protein fractions received this way were enriched by cytosolic proteins, membrane proteins and nuclear proteins. By means of MALDI analysis 45 proteins from the fraction enriched by membrane proteins and 23 proteins from the fraction enriched by nuclear proteins were identified. For the detection of blood-brain barrier specific proteins, the protein samples from brain microvessel endothelial cells were compared with those from aorta endothelial cells, which do not possess a barrier function. Altogether 11 proteins were identified, which are expressed in brain microvessel endothelial cells but not in aorta endothelial cells. Three of the identified proteins were expressed at least twice as strongly in brain microvessel endothelial cells. Under the differentially expressed proteins was a previously undescribed isoform of the Ca2+/calmodulin-dependent kinase alpha (alphaCamKII). The protein is beside the CamKII associated protein alpha-KAP the only isoform described so far, that does not exhibit kinase activity and is probably specifically expressed in the brain. The substantial difference to alpha-KAP is the absence of a 11 AA sequence, which contains a potential nuclear localization signal. The protein probably plays a role in the intracellular targeting of the Ca2+/calmodulin-dependent kinase just like alpha-KAP and would therefore have an indirect function during the forwarding of numerous extracellular signals.