Über die Etablierung neuartiger Verfahren zur DNA vermittelten in vitro Genotyp-Phänotyp-Kopplung
Über die Etablierung neuartiger Verfahren zur DNA vermittelten in vitro Genotyp-Phänotyp-Kopplung
In dieser Arbeit sollte ein neuartiges Verfahren zur Genotyp-Phänotyp-Kopplung etabliert werden, bei dem das zu präsentierende Polypeptid direkt oder über Microbeads mit dem kodierenden DNA Molekül verknüpft ist. Dies wurde unter Verwendung der HaloTag® Technologie erfolgreich umgesetzt, wobei sich die direkte Verknüpfung von Polypeptid und kodierendem DNA Molekül als zielführend erwies. Bei dem als HaloTag®-DNA-display bezeichneten Verfahren wird zunächst eine HaloLink® Bindungsgruppe über modifizierte PCR Primer in die Matrizen DNA eingebaut, welche für ein Fusionsprotein aus dem HaloTag®-Bindeprotein und dem zu präsentierenden Peptid kodiert. Nach Expression können die neusynthetisierten HaloTag®-Fusionsproteine die Bindungsgruppe der DNA-Matrize binden, wodurch kovalente DNA-Protein-Komplexe entstehen. Die Ausbildung dieser DNA-Protein-Komplexe konnte durch Mischen zweier unterschiedlicher Komplexe und Affinitätsselektion einer der Varianten nachgewiesen werden. In einem weiteren Mischungsexperiment konnte durch die Anreicherung eines Genotyps, aus einem Gemisch zweier Genotyp Varianten, eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung, also die Kopplung des Fusionsproteins mit dem kodierenden DNA Molekül nachgewiesen werden. Hierzu wurden die DNA-Matrizen Moleküle in Wasser-in-Öl-Emulsion exprimiert, wobei die Konzentration an DNA-Matrize so gewählt wurde, dass statistisch nur ein DNA-Molekül pro Kompartiment vorliegt. Weiter konnte eine vollrandomisierte Peptidbibliothek erstellt werden, die in Modellexperimenten zur Anreicherung von Zielprotein bindenden Peptidsequenzen eingesetzt wurde. Hierbei wurden vier bis fünf aufeinanderfolgende Selektionsrunden auf Bindung eines immobilisierten Zielproteins durchgeführt und einzelne Variante im Anschluss analysiert. Durch diese Experimente konnte die Praxistauglichkeit des HaloTag®-DNA-displays bestätigt werden.
In this study a new procedure for genotype-phenotype-linkage should be established that links the presenting polypeptide directly or via microbeads with its coding DNA molecule. This was successfully implemented using the HaloTag® Technology, though the direct linkage of polypeptide and coding DNA molecule proved to be successful. In the as HaloTag®-DNA-display termed procedure a HaloLink® binding group is initially incorporated into the DNA template via PCR, encoding for a fusion protein consisting of the HaloTag® binding protein and the presenting peptide. Following expression the newly synthesized HaloTag® fusion proteins can bind to the binding group of the DNA template generating covalent DNA-protein-complexes. By mixing two different variants of DNA-protein-complexes following affinity selection of one variant the formation of these complexes could be demonstrated. In a second mixing experiment one genotype of out of a mixture of two genotype variants could be enriched, proving a linkage of the HaloTag® fusion protein with its own encoding DNA molecule, a genotype-phenotype-linkage, is established. For this the DNA template molecules are expressed in water-in-oil-emulsion, using a DNA template concentration that provides statistically one DNA molecule per water compartment. After that a fully randomized peptide library was constructed, which was used in model experiments to enrich target protein binding peptide sequences. Four to five consecutive selection rounds were carried out, selecting variants that bind to an immobilized target protein. Following subsequent analysis of single variants, the suitability of the HaloTag®-DNA-display could be confirmed.
