Die Beteiligung von Nek1 an der Homologen Rekombination

Während der Evolution haben Organismen verschiedene Mechanismen entwickelt, um DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) effizient zu reparieren und somit ihre genomische Information bestmöglich zu bewahren. Die Homologe Rekombination (HR) stellt in humanen Zellen einen von zwei Hauptwegen zur Reparatur von DSBs dar. Das Grundprinzip der HR kann wie folgt zusammengefasst werden: Nach der Induktion von DSBs werden zunächst die DSB-Enden resektiert, wodurch einzelsträngige DNA-Bereiche entstehen. Diese einzelsträngige DNA wird daraufhin mit dem Protein Rad51 beladen, sodass sich ein Nukleoproteinfilament ausbildet. Dieses Filament sucht nach der komplementären DNA-Sequenz im Schwesterchromatid. Die gefundene homologe DNA Sequenz wird schließlich als Vorlage genutzt, um die zerstörte oder resektierte DNA wieder neu zu synthetisieren. Um die DNA-Synthese initiieren zu können, müssen allerdings die zuvor beladenen Rad51-Moleküle von der DNA entfernt werden. Diese Dissoziation der Rad51-Moleküle wird von dem Protein Rad54 katalysiert, welches Rad51 kontroverserweise bereits bei frühen HR-Schritten assistiert und stabilisiert. Die Regulierung dieser gegensätzlichen Rad54-Funktionen sowie die Rad51 Dissoziation von der DNA sind bislang nur unzureichend verstanden. Mit dieser Dissertation wurde ein Beitrag zum Verständnis der Regulierung von Rad54 bei der HR geleistet. Die Kinase Nek1 (Never-in-mitosis A related protein kinase 1) konnte hierbei als neuer HR Faktor identifiziert werden, welcher die unterschiedlichen Funktionen von Rad54 reguliert. So wurde gezeigt, dass Rad54 von Nek1 am Serin572 phosphoryliert wird und dadurch die effiziente Reparatur von DSBs über HR ermöglicht. Diese Phosphorylierung von Rad54 findet erst zu späten Zeiten nach DNA Schadensinduktion statt und zeitgleich wird die Bildung von stabilen Rad51/Rad54-Komplexen induziert. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen diesen Beobachtungen besteht und folglich die Phosphorylierung am Serin572 die Bildung von stabilen Rad54/Rad51-Komplexen bewirkt. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit herausgefunden, dass die Phosphorylierung von Rad54 die Rad51-Dissoziation zu späten HR-Schritten fördert. Diese Beobachtungen führen zu der Schlussfolgerung, dass phosphoryliertes Rad54 aufgrund seiner veränderten biochemischen Eigenschaften im Komplex zusammen mit Rad51 von der DNA dissoziiert. Nach erfolgter Dissoziation von Rad51 und Rad54 kann folglich die Rekombinations assoziierte DNA-Synthese eingeleitet und die HR erfolgreich beendet werden. Mit der Identifizierung der neuen Rad54-Phosphorylierungsstelle am Serin572 wurde also ein molekularer Schalter identifiziert, der es zum einen erlaubt, die unterschiedlichen Rad54-Funktionen während der HR zu erklären, und zum anderen die Regulation der Rad51-Dissoziation von der DNA beschreibt.

During evolution cells have developed efficient mechanisms to repair DNA double-strand breaks (DSBs) and thereby maintain genomic integrity. Homologous recombination (HR) is one of the two major repair pathways in mammalian cells. The initial step of HR involves DNA end-resection to generate single-stranded DNA (ssDNA) tails. Recruitment and binding of Rad51 to ssDNA allows strand invasion of the nucleoprotein filament into the homologous DNA sequence of the sister chromatid. Finally, during the process of recombination-associated DNA synthesis a DNA polymerase extends the 3´end of the invading strand. However, to allow recombination-associated DNA synthesis, Rad51 must be removed from the DNA. This process is predominantly catalyzed by Rad54, although Rad54 shares opposing functions at earlier steps of HR where it assists and stabilizes Rad51 on ssDNA. The removal of Rad51 from DNA is poorly understood and a potential regulatory mechanism for the contrary Rad54 functions during HR has not yet been described. In this study the never-in-mitosis A related protein kinase 1 (Nek1) was identified as a novel regulator for Rad54 during HR. It was shown that Nek1 phosphorylates Rad54 at serine572 during late times after DNA damage induction. Simultaneously to this phosphorylation, the complex formation of Rad51 and Rad54 also arises at late stages of HR. Strikingly, both observations could be linked by showing that the phosphorylation of Rad54 at serine572 promotes the formation of stable Rad54/Rad51 complexes. Furthermore, the phosphorylation of Rad54 supports the removal of Rad51 from DNA. In conclusion, these data suggest a novel role for Nek1 during HR by phosphorylating Rad54, which then promotes its dissociation from the DNA in a complex together with Rad51. After removing Rad51 from the DNA, recombination-associated DNA synthesis can proceed to accomplish HR-mediated DSB repair. By identifying a novel Rad54 phosphorylation site on serine572, a molecular switch could be uncovered. The separation of the diverse functions of Rad54 allows a direct control of the Rad54 involvement during different steps of HR, including the dissociation of Rad51.