Aufbau eines Mikrobleichsystems an der GSI Schwerionen-Mikrosonde und dessen biologische Anwendungen

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Aufbau und der Integrierung eines Lasersystems zur Untersuchung der Austauschkinetik fluoreszenzmarkierter Ku80 Reparaturproteine an strahleninduzierten DNA Schädigungen, welche durch gezielte Ionenbestrahlung mittels der Schwerionen-Mikrosonde der GSI erzeugt werden. Zur Messung dieser schnellen Austauschkinetik, mit wenigen Sekunden Halbwertszeit, muss auch die räumliche und zeitliche Auflösung des dedizierten in-situ Mikroskopes verbessert werden. Diese Verbesserungen erlauben es, dass die zuvor nur ex-situ beobachtbare Dekondensation von heterochromatischen Bereichen mit dichter DNA nun auch in-situ beobachtet werden kann und zusätzlich speziesübergreifend nachgewiesen wird. Bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen entlang des Reparaturmechanismus der „Nicht Homologen Endverknüpfung“ spielt Ku80 eine entscheidende, frühe Rolle. Durch die gezielte Bestrahlung von Zentren unterschiedlicher Chromatindichte kann mit dem verbesserten Mikroskop der Mikrosonde gezeigt werden, dass Ku80-GFP für die Akkumulation in Heterochromatin (HC) signifikant länger benötigt als in Euchromatin (EC). Im Rahmen der Untersuchung des Austausches von Ku80-GFP in diesen geschädigten Bereichen von HC und EC wird das Lasersystem genutzt, um gezielt die lokale Fluoreszenz durch Bleichen zu deaktivieren und den Austausch von gebleichten durch benachbarte ungebleichte Ku80-GFP Molekülen aufzunehmen. Diese Methode ist als FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) bekannt. Dabei zeigt sich, dass der Austauschvon Ku80-GFP im dichten HC langsamer als im weniger dichten EC stattfindet.

This study tackles the setup and integration of a laser system to measure the turnover of repair protein Ku80, labeled with a fluorescent marker, at DNA damage sites that are produced by targeted ion irradiation at the heavy-ion microprobe of GSI. To measure this fast turnover, with half-times of some seconds, spatial and temporal resolution of the dedicated in-situ microscope has to be improved. These improvements also allow for in-situ observation of the previously only ex-situ detectable decondensation of heterochromatic regions with higher DNA concentrations that is additionally found to be species conserved. During the repair of double strand breaks along the „non-homologous end joining“ repair pathway repair protein Ku80 plays a critical early role. By targeted irradiation of centers of different chromatin density the accumulation of Ku80-GFP in heterochromatin (HC) is significant slower then in euchromatin (EC). To investigate the exchange of Ku80-GFP at the damage sites in HC and EC the laser system is used for targeted deactivation of the fluorescent behaviour by bleaching and subsequent recording of the exchange of bleached Ku80-GFP molecules with neighboring fluorecent molecules. This technique is known as fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). It is found, that the exchange of Ku80-GFP in the dense HC is slower than in in the less dense EC.