Analyse von krankheitsassoziierten Mutationen des NMDA-Rezeptors und Entwicklung therapeutischer Ansätze

Der N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA-Rezeptor) ist ein ionotroper Glutamatrezeptor, der eine essenzielle Rolle in der neuronalen Signalübertragung, synaptischen Plastizität, Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) und in der Pathophysiologie vieler neurologischer Erkrankungen spielt. Physiologisch ist er entscheidend für die Gedächtnisbildung und das Lernen. Auf molekularer Ebene besteht der konventionelle NMDA-Rezeptor aus zwei Glycin-bindenden GluN1- (codiert durch GRIN1) und zwei Glutamat-bindenden GluN2-Untereinheiten (codiert durch GRIN2A-D). Im Vergleich zur ubiquitär im ZNS exprimierten GluN1-Untereinheit zeigen die GluN2-Untereinheiten spezifische räumlich-zeitliche Expressionsprofile. Alle Untereinheiten sind modular aus vier Domänen aufgebaut: einer extrazellulären N-terminalen Domäne für die Bindung von Modulatoren, einer Ligandenbindungsdomäne für die Bindung der Agonisten Glycin bzw. Glutamat, einer Transmembrandomäne für die Ausbildung der Ca²⁺-permeablen Kanalpore mit dem spannungsabhängigen Mg²⁺-Block und eine C-terminale Domäne für Wechselwirkungen mit intrazellulären Signalwegen. Mutationen in allen vier Domänen der Untereinheiten GluN1, GluN2A und GluN2B wurden in den letzten Jahren als ursächlich für verschiedene neuropsychiatrische und neurologische Krankheitsbilder identifiziert. Ziel dieser Arbeit war die systematische funktionelle Charakterisierung von unterschiedlichen krankheitsassoziierten Mutationen des Rezeptors, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen zu etablieren und potenzielle therapeutische Ansätze zu evaluieren.

Im Jahr 2010 wurden erstmals Mutationen in der GluN2A-Untereinheit des NMDA-Rezeptors speziell mit Epilepsieformen bei Kindern in Verbindung gebracht. In den folgenden Jahren wurden durch Sequenzierungen in den GluN1-, GluN2A- und GluN2B-Untereinheiten eine Vielzahl von weiteren Mutationen gefunden, die über das Krankheitsbild der Epilepsie hinaus, u.a. mit Entwicklungsstörungen, mentaler Retardierung und Autismus-Spektrum-Störungen assoziiert sind. Durch die Entdeckung dieser Mutationen in verschiedenen NMDA-Rezeptor-Untereinheiten wurde klar, dass unterschiedliche Dysregulationen des Rezeptors während der kindlichen Entwicklung und neuronalen Signalübertragung eine bedeutende Rolle bei den verschiedenen Krankheitsbildern spielen muss. Aufgrund der Vielzahl von Mutationen in den GluN1- und GluN2A/B- Untereinheiten in verschiedenen Domänen war das Ziel der Arbeit eine funktionelle Charakterisierung der rezeptorassoziierten Mutationen zu erstellen, um im Anschluss eine Phänotyp-Genotyp-Korrelation zu ermöglichen und eine klinische Relevanz abzuleiten. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden somit in dieser Arbeit insgesamt 31 krankheitsassoziierte Mutationen in Wildtyp-Konstrukten der GluN1-, GluN2A- und GluN2B-Untereinheit erzeugt und mithilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) elektrophysiologisch nach heterologer Expression in Xenopus laevis Oozyten vermessen. Die systematischen Analysen der Agonistenaffinitäten, der maximal-induzierbaren Stromstärke, der allosterischen Modulation durch Zink und Magnesium bei Wildtyp-, mutierten und Misch-Rezeptoren zeigen, dass aufgrund der elektrophysiologischen Ergebnisse Mutationen in Gruppen von verstärkter und verminderter Rezeptor-Funktion („gain-“ oder „loss-of-function“) eingeteilt werden können. Mutationen in Ligandenbindungsdomänen der GluN1- und GluN2B-Untereinheit bewirken überwiegend Funktionsverluste, während GluN2A-Mutationen oft eine Funktionserhöhung aufweisen. Phänotypisch konnte den „gain-of-function“ Mutationen der GluN2A-Untereinheit als Leitsymptom epileptische Anfälle zugeordnet werden, wohingegen „loss-of-function“ Mutationen der GluN2B-Untereinheit eher mit Erkrankungen des Formenkreises der mentalen Retardierung einhergingen. Die Analyse von GluN1-Mischrezeptoren bestätigte, dass Mutationen in GluN1-Untereinheit häufig zu schwerwiegenden Phänotypen bei homozygoter Expression führen, während heterozygote Träger asymptomatisch sein können. Um eine zielgerichtete Therapie zu ermöglichen, scheint letztendlich doch die Charakterisierung der einzelnen Mutationen essenziell zu sein. Agonisten bzw. Kanalblocker wären mögliche Behandlungsansätze. Der für die Alzheimer Demenz zugelassene Kanalblocker Memantin wurde bei Kindern mit NMDA-Rezeptor Mutationen und schweren Symptomen probatorisch eingesetzt und war in Einzelfällen therapeutisch wirksam. Auch in dieser Arbeit konnte in vitro ein signifikanter Einfluss auf eine „gain-of-funtion“ Mutation nachgewiesen werden. In größeren Studien waren die Effekte jedoch nicht objektivierbar. Entscheidend scheint das Zusammenspiel vieler Faktoren wie die betroffene Domäne, die phänotypische Ausprägung, das Patientenalter sowie die Verstoffwechslung des Medikamentes zu sein. Die Ergebnisse meiner Arbeit unterstreichen die Bedeutung einer individuellen funktionellen Charakterisierung von NMDA-Rezeptor-Mutationen zur Entwicklung personalisierter Therapieansätze bei kanalopathie-assoziierten neurologischen Erkrankungen. Der große Fokus der Zukunft liegt somit in der personalisierten Medizin mit Entwicklung neuer modulatorischer Wirkstoffe in Kombination mit Struktur-Funktions-Analysen jeder Mutation zur Etablierung einer individuell zugeschnittenen Therapie.

The N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA receptor) is an ionotropic glutamate receptor that plays an essential role in neuronal signaling, synaptic plasticity, central nervous system (CNS) development, and the pathophysiology of many neurological disorders. Physiologically, it is crucial for memory formation and learning. At the molecular level, the conventional NMDA receptor is composed of two glycine-binding GluN1 (encoded by GRIN1) and two glutamate-binding GluN2 subunits (encoded by GRIN2A-D). Compared to the GluN1 subunit, which is expressed ubiquitously in the CNS, the GluN2 subunits exhibit specific spatial and temporal expression patterns. All subunits are modularly constructed from four domains: an extracellular modular binding N-terminal domain, a glycine and glutamate agonist-ligand-binding domain, a transmembrane domain which is essential for building the Ca²⁺-permeable channel pore with the voltage-dependent Mg²⁺ block, and a C-terminal domain important for interactions with intracellular signaling pathways. Mutations in all four domains of the GluN1, GluN2A, and GluN2B subunits have been identified in recent years as the cause of various neuropsychiatric and neurological disorders.

In 2010, mutations in the GluN2A subunit of the NMDA receptor were initially linked to forms of epilepsy in children. In the following years, sequencing of the GluN1, GluN2A, and GluN2B subunits revealed many additional mutations that are associated with intellectual disability, developmental delay, mental retardation, and autism spectrum disorders, among other conditions, beyond the clinical picture of epilepsy. The discovery of these mutations in various NMDA receptor subunits demonstrated that different dysregulations of the receptor during childhood development and neuronal signal transmission must play a significant role in the various clinical pictures. The aim of this work was to systematically characterize the function of different disease-associated mutations of the receptor to establish genotype-phenotype correlations and evaluate potential therapeutic approaches. Due to the large number of mutations in the GluN1 and GluN2A/B subunits in different domains, we developed a strategy to perform a functional characterization of the receptor-associated mutations to subsequently enable a phenotype-genotype correlation and derive clinical implications. Using site-directed mutagenesis, a total of 31 disease-associated mutations were generated in wild-type constructs of the GluN1, GluN2A, and GluN2B subunits and measured electrophysiological properties using two-electrode voltage clamp (TEVC) after heterologous expression in Xenopus laevis oocytes. Based on the systematic analyses and electrophysiological results of agonist affinities, peak current, and allosteric modulation by zinc and magnesium in wild-type, mutant, and mixed receptors, mutations can be classified of increased and decreased receptor function (“gain-of-function” or “loss-of-function”). Mutations in ligand-binding domains of the GluN1 and GluN2B subunits predominantly cause loss of function, while GluN2A mutations often show an increase in function. Phenotypically, “gain-of-function” mutations of the GluN2A subunit can be associated with epilepsy as the main symptom, whereas “loss-of-function” mutations of the GluN2B subunit were more likely to be associated with mental retardation, intellectual disability and development delay. Analysis of GluN1 mixed receptors confirmed that mutations in the GluN1 subunit often led to severe phenotypes in homozygous expression, while heterozygous carriers may be asymptomatic. Ultimately, the characterization of individual mutations appears to be essential to enable targeted therapies. The use of agonists or channel blockers for example, could be possible treatment approaches. The channel blocker memantine, which is approved for Alzheimer's dementia, has been used on a trial basis in children with NMDA receptor mutations and severe symptoms and has been therapeutically effective in individual cases. In this study, a significant influence on a “gain-of-function” mutation was also demonstrated in vitro. However, the effects could not be objectively verified in larger studies. The interaction of many factors, such as the affected domain, the phenotypic expression, the patient's age, and the metabolism of the drug, appears to be decisive. The results of my work emphasize the importance of individual functional characterization of NMDA receptor mutations for the development of personalized therapeutic approaches to channelopathy-associated neurological diseases. Future research will be focused on personalized medicine, with the development of new modulatory agents in combination with structure-function analyses of each mutation to establish individually tailored therapies.