Development of NKG2D-specific killer cell engagers for cancer immunotherapy

In recent years, the development of immune checkpoint inhibitors and CAR-engineered lymphocytes has revolutionized the landscape of cancer therapy. However, several challenges remain that impede therapy efficacy, such as the development of resistance to immune checkpoint inhibitor therapy and heterogeneous tumor antigen expression. Additionally, toxicities with potentially severe consequences are frequently observed in CAR-T cell therapy. To overcome some of these challenges, our group has developed an approach that comprises NK-92 cells engineered with an NKG2D-based CAR (termed NKAR) in combination with a bispecific killer cell engager (termed NKAB-ErbB2) targeting NKG2D and the tumor antigen ErbB2 (HER2), thereby harnessing the promising safety profile and potent activity of CAR-NK cells, along with the flexibility of a modular CAR approach. This prototypic NKAB-ErbB2 molecule not only enhanced the lytic activity of NKAR-NK-92 cells against tumor cells expressing both, NKG2D ligands (NKG2DLs) and ErbB2, but also allowed the targeted elimination of NKG2DL-negative but ErbB2-positive tumor cells, which would otherwise have escaped NKG2D-mediated immune surveillance. Moreover, the combination of NKAR-NK-92 cells with NKAB-ErbB2 prevented tumor growth in the majority of animals in a syngeneic GL261/ErbB2 mouse glioblastoma model and markedly prolonged survival. To extend the repertoire of tumor antigens that can be targeted by this modular NKAB-NKAR system, a PD-L1-specific NKAB molecule specifically interacting with human NKG2D (termed hNKAB-PDL1) was developed in this work, aiming to exploit the broad expression of PD-L1 across many tumor entities. Thereby, the employed PD-L1-specific scFv domain derived from the immune checkpoint inhibitor atezolizumab enabled high-affinity binding of hNKAB-PDL1 to both, human and murine PD-L1 on tumor cell lines, without interfering with the engagement of NKG2D on cytotoxic lymphocytes such as NK, NKT and CD8⁺ T cells. This bispecific interaction of hNKAB-PDL1 facilitated the redirection of cytotoxic activity from human lymphocytes towards PD-L1ʰᶦᵍʰ tumor targets, while PD-L1⁻ or PD-L1ˡᵒʷ targets were spared from lysis. Also, a murine NKAB-PDL1 variant was developed to engage murine NKG2D (termed mNKAB-PDL1), thereby serving as a surrogate molecule for potential future studies and thorough evaluation of a PD-L1-specific NKAB molecule in immunocompetent mice. mNKAB-PDL1 bound specifically to murine NKG2D-positive lymphocytes and, similar to the human variant, mediated selective lysis of PD-L1ʰᶦᵍʰ tumor cells by murine effector cells. Given that human and murine PD-L1-specific NKAB molecules both incorporated the scFv domain from atezolizumab, they also exhibited potent immune checkpoint inhibitor activity in a cell-based PD-1/PD-L1 blockade assay. In the second part of this work, the PD-L1-specific NKAB molecules were combined with NKAR-modified NK-92 cells. In addition to the prototypic NKG2D-CAR based on human NKG2D (therefore termed hNKAR), a murine NKAR construct (mNKAR) was developed that employs the extracellular domain of murine NKG2D to enable its combination with mNKAB molecules as a modular CAR approach. In contrast to hNKAR-NK-92 cells, which only enhanced lysis of human NKG2DL-positive tumor cells, mNKAR-NK-92 cells mediated potent lysis of both, human and murine NKG2DL-positive target cells. The ability of hNKAB-PDL1 and mNKAB-PDL1 to selectively recognize and activate the respective NKAR-NK-92 cells was confirmed by binding and degranulation assays. As observed in experiments with primary lymphocytes, the PD-L1-specific molecules potently enhanced the lytic activity of NKAR-NK-92 cells against PD-L1ʰᶦᵍʰ tumor targets, whereas PD-L1⁻ and PD-L1ˡᵒʷ were not affected. Heterogenous tumor antigen expression is a common challenge in cancer immunotherapy, especially for approaches targeting only a single antigen, as residual tumor cells are able to drive relapse. Therefore, the effects of combining ErbB2- and PD-L1-specific NKAB molecules with NKAR-NK-92 cells were evaluated. To study efficacy of the approach in preclinical experiments employing both, human and murine effector cells, in addition to the previously established hNKAB-ErbB2 molecule, an ErbB2-specific mNKAB variant (mNKAB-ErbB2) was generated and evaluated in this work. As a model system, parental GL261 glioblastoma cells and ErbB2-expressing GL261/ErbB2 cells were transduced to ectopically express human PD-L1, yielding a panel of cell lines that express either none, one or both of the target antigens ErbB2 and PD-L1. After confirming specific binding of hNKAB and mNKAB molecules to ErbB2- or PD-L1-expressing target cells, their ability to mediate selective lysis of tumor-antigen-positive target cells was demonstrated using the respective NKAR-NK-92 cells. Importantly, a mixture of ErbB2- and PD-L1-specific NKAB molecules was as effective as a single NKAB molecule of suitable specificity in eliminating tumor cells expressing ErbB2, PD-L1 or both antigens. However, combining both NKAB molecules improved the efficacy against heterogeneous tumor cell populations, modeled by co-cultures of GL261/ErbB2 and GL261/PD-L1 cells. Finally, the in vivo activity of hNKAB-PDL1 combined with NGK2D-CAR-modified NK-92 cells was assessed in a subcutaneous GL261/ErbB2/PD-L1 glioblastoma model in immunodeficient NSG mice and compared with that of the prototypic hNKAB-ErbB2 molecule. Thereby, due to the aggressive growth of the tumors, the treatment demonstrated only modest efficacy. However, co-administration of hNKAB-ErbB2 or hNKAB-PDL1 with NKG2D-CAR NK-92 cells still resulted in a statistically significant increase in survival compared to untreated mice. Furthermore, co-administration of hNKAB-PDL1 and NKG2D-CAR NK-92 cells induced a significant delay in tumor progression at early time points compared to the other treatments, suggesting enhanced activity of the PD-L1-specific molecule. To enable the use of the same molecules for preclinical evaluation with both, human and murine lymphocytes, novel scFv antibody domains cross-reactive with human and murine NKG2D were developed in the last part of this work. In collaboration with the group of Prof. Harald Kolmar (TU Darmstadt), a hen was immunized with the extracellular domains of human and murine NKG2D, followed by the generation of an scFv library and screening using yeast surface display, which resulted in the isolation of four species cross-reactive antibody domains (termed sc domains). After confirming their high-affinity binding to human and murine NKG2D and NKAR receptors, as well as their ability to activate NKAR-NK-92 cells, the novel scFv fragments were incorporated into the ErbB2-specific NKAB format (termed scNKAB-ErbB2). As expected, in contrast to species-restricted hNKAB-ErbB2 and mNKAB-ErbB2 molecules, scNKAB-ErbB2 antibodies were able to potently redirect the lytic activity of both, human and murine lymphocytes to ErbB2-positive tumor targets. Additionally, scNKAB-ErbB2 molecules mediated superior lysis of ErbB2-positive breast carcinoma cells by NKAR-NK-92 cells compared to the reference molecules and demonstrated a wider therapeutic window. Through the combination of in silico protein-protein interaction simulations and in vitro competitive binding assays in the presence of soluble NKG2D ligand MICA (sMICA), two of the sc domains were identified as competitive binders that prevent the interaction of sMICA with human NKG2D/NKAR. Moreover, while the species-restricted hNKAB-ErbB2 molecule also inhibited the binding of sMICA to NKG2D/NKAR at lower ligand concentrations, competing scNKAB-ErbB2 molecules were significantly more potent in preserving the lytic activity of hNKAR-NK-92 cells against ErbB2-positive breast carcinoma cells in the presence of high concentrations of sMICA. The findings obtained in this work emphasize the flexibility of the modular NKAB-NKAR system as both, PD-L1-specific NKAB molecules and novel species cross-reactive scNKAB-ErbB2 variants could readily be combined with NKAR-NK-92 cells without compromising antitumor activity. These results warrant further investigation of NKAB-PDL1 molecules in immunocompetent mouse tumor models, where their combined functionality as engagers and immune checkpoint inhibitors could be thoroughly evaluated. Likewise, the novel scNKAB molecules with species cross-reactive binding to NKG2D represent a promising foundation for the development of future NKAB constructs. In combination with binding domains targeting both, human and murine variants of tumor antigens, such as the PD-L1-specific scFv fragment used in this work, fully human/mouse cross-reactive molecules could be generated, which would allow a comprehensive preclinical evaluation of antitumor activities and potential adverse effects.

In den letzten Jahren hat die Entwicklung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren und CAR-modifizierten Lymphozyten die Behandlung vieler Krebserkrankungen revolutioniert. Jedoch bestehen weiterhin Herausforderungen, welche die Therapieeffizienz einschränken, wie die Entwicklung von Therapieresistenz gegenüber Immun-Checkpoint-Inhibitoren und die heterogene Expression von Tumorantigenen. Zudem treten insbesondere bei der Behandlung mit CAR-T Zellen Toxizitäten mit potenziell schwerwiegendem Verlauf auf. Um einige dieser Limitationen zu überwinden, hat unsere Arbeitsgruppe einen neuartigen Therapieansatz entwickelt, bei dem NKG2D-CAR-exprimierende NK-92 Zellen (NKAR-NK-92) mit einem bispezifischen NK-Zell-Engager (NKAB-ErbB2) kombiniert werden, der sowohl NKG2D als auch das Tumorantigen ErbB2 (HER2) bindet. Dadurch wird das im Vergleich zu CAR-T Zellen vielversprechende Sicherheitsprofil von CAR-NK Zellen mit der Flexibilität eines modularen CAR-Ansatzes vereint. Das prototypische NKAB-ErbB2-Molekül steigerte hierbei nicht nur die zytotoxische Aktivität der NKAR-NK-92 Zellen gegenüber Tumorzellen, die sowohl NKG2D-Liganden (NKG2DLs) als auch ErbB2 exprimieren, sondern ermöglichte zudem die gezielte Eliminierung von NKG2DL-negativen aber ErbB2-positiven Tumorzellen, die andernfalls der endogenen NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen würden. Weiterhin verhinderte die Kombination von NKAR-NK-92 Zellen und NKAB-ErbB2 das Tumorwachstum in der Mehrzahl der Tiere in einem syngenen GL261/ErbB2 Maus-Glioblastommodell und verlängerte deren Überleben deutlich. Um das Repertoire an Tumorantigenen zu erweitern, die mit dem modularen NKAB-NKAR-System adressiert werden können, und die breite PD-L1-Expression in zahlreichen Tumorentitäten therapeutisch nutzbar zu machen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein PD-L1-spezifisches NKAB-Molekül mit Selektivität für humanes NKG2D (hNKAB-PDL1) generiert. Hierfür wurde ein von dem zugelassenen Immun-Checkpoint-Inhibitor Atezolizumab abgeleitetes PD-L1-spezifisches scFv-Fragment in das hNKAB-Molekül integriert, wodurch eine hochaffine Bindung von hNKAB-PDL1 sowohl an humanes als auch murines PD-L1 auf Tumorzellen ermöglicht wurde, unter Beibehaltung der Interaktion mit NKG2D auf humanen zytotoxischen Lymphozyten wie NK, NKT und CD8⁺ T Zellen. Durch diese bispezifische Bindung vermittelte hNKAB-PDL1 die gezielte Lyse von PD-L1ʰᶦᵍʰ Tumorzellen durch humane Lymphozyten, während PD-L1⁻ oder PD-L1ˡᵒʷ Zielzellen von der lytischen Aktivität verschont blieben. Da die NKG2D-spezifische scFv-Domäne in den prototypischen hNKAB-Molekülen ausschließlich mit humanem NKG2D interagiert, wurde zudem eine murine Variante entwickelt, die an murines NKG2D bindet (mNKAB-PDL1). Dies soll eine umfassende präklinische Evaluation PD-L1-spezifischer NKAB-Moleküle in zukünftigen Studien mit immunkompetenten Mäusen ermöglichen. mNKAB-PDL1 interagierte spezifisch mit murinen NKG2D-positiven Lymphozyten und leitete analog zur humanen Variante deren Zytotoxizität selektiv gegen PD-L1ʰᶦᵍʰ Tumorzellen um. Durch die Verwendung der Bindedomäne von Atezolizumab wiesen beide PD-L1-spezifischen NKAB-Moleküle zudem eine ausgeprägte Immun-Checkpoint-Inhibitor-Aktivität in einem zellbasierten PD-1/PD-L1-Blockade-Assay auf. Nachfolgend wurden die in dieser Arbeit generierten PD-L1-spezifischen NKAB-Moleküle mit NKAR-NK-92 Zellen zur Steigerung der antitumoralen Aktivität kombiniert. Für die funktionelle Charakterisierung des mNKAB-PDL1-Moleküls innerhalb des modularen NKAB-NKAR-Ansatzes wurde als Erweiterung zu dem auf humanem NKG2D-basierenden NKAR (nachfolgend hNKAR) ein murines NKAR-Konstrukt (mNKAR) entwickelt, das die extrazelluläre Domäne des murinen NKG2D-Rezeptors enthält. Im Vergleich zu hNKAR-NK-92 Zellen, die lediglich eine erhöhte Lyse von humanen NKG2DL-positiven Tumorzellen zeigten, konnten mNKAR-NK-92 Zellen sowohl murine als auch humane NKG2DL-positive Krebszellen eliminieren. Die Fähigkeit von hNKAB-PDL1 und mNKAB-PDL1, selektiv die jeweiligen NKAR-NK-92 Zellen zu erkennen und dadurch zu aktivieren, wurde in Bindungs- und Degranulations-Assays bestätigt. Wie schon in den Zytotoxizitäts-Assays mit primären Lymphozyten beobachtet, steigerten die PD-L1-spezifischen NKAB-Moleküle die zytotoxische Aktivität von NKAR-NK-92 Zellen gezielt gegen PD-L1ʰᶦᵍʰ Tumorzellen, während PD-L1⁻ und PD-L1ˡᵒʷ Zielzellen von dieser lytischen Aktivität ausgenommen blieben. Die heterogene Expression von Tumorantigenen stellt ein häufiges Problem in der Krebsimmuntherapie dar, insbesondere bei Therapieansätzen, die sich nur auf ein Antigen beschränken. Hierbei wird lediglich ein Teil des Tumors beseitigt und die verbleibenden Antigen-negativen Tumorzellen können ein Rezidiv auslösen. Deshalb wurde die Wirksamkeit der Kombination von ErbB2- und PD-L1-spezifischen NKAB-Molekülen mit NKAR-NK-92 Zellen untersucht. Um die Effektivität dieses Therapieansatzes in präklinischen Experimenten sowohl mit humanen als auch murinen Effektorzellen analysieren zu können, wurde zusätzlich zu dem zuvor entwickelten hNKAB-ErbB2-Molekül ein ErbB2-spezifisches mNKAB-Molekül (mNKAB-ErbB2) generiert und funktionell charakterisiert. Als Modellsystem wurden die parentale Glioblastomzelllinie GL261 und ErbB2-exprimierende GL261/ErbB2 Zellen mittels lentiviraler Transduktion mit humanem PD-L1 ausgestattet. Dadurch entstand ein Panel von GL261 Zelllinien, die entweder keines, eines oder die beiden Zielantigene ErbB2 und PD-L1 exprimieren. Nach Bestätigung der spezifischen Bindung der ErbB2- bzw. PD-L1-spezifischen hNKAB- und mNKAB-Moleküle an die jeweiligen Tumorzelllinien konnte gezeigt werden, dass die NKAB-Moleküle in Kombination mit den entsprechenden NKAR-NK-92 Zellen eine hochselektive Lyse der Antigen-positiven Tumorzellen vermitteln. Die Kombination von ErbB2- und PD-L1-spezifischen NKAB-Molekülen war dabei ebenso wirksam wie der alleinige Einsatz eines NKAB-Antikörpers mit passender Spezifität bei der Eliminierung von GL261 Zellen, die ErbB2, PD-L1 oder beide Antigene exprimierten. Jedoch verbesserte die Kombination der NKAB-Moleküle signifikant die Lyse einer heterogenen Tumorzellpopulation, die durch eine Ko-Kultur aus GL261/ErbB2 und GL261/PD-L1 Zellen modelliert wurde. Abschließend wurde die in vivo Aktivität des hNKAB-PDL1-Moleküls in Kombination mit NKG2D-CAR-modifizierten NK-92 Zellen in einem subkutanen GL261/ErbB2/PD-L1 Glioblastommodell in immundefizienten NSG-Mäusen analysiert und mit jener des prototypischen hNKAB-ErbB2-Moleküls verglichen. Aufgrund des aggressiven Tumorwachstums in diesem Modell zeigte die Behandlung nur eine begrenzte Wirksamkeit. Dennoch führte die Ko-Administration von hNKAB-PDL1 oder hNKAB-ErbB2 mit NKG2D-CAR NK-92 Zellen zu einer statistisch signifikanten Verlängerung des Überlebens im Vergleich zu unbehandelten Mäusen. Zudem bewirkte die Kombination von hNKAB-PDL1 und den Effektorzellen eine signifikante Verzögerung des initialen Tumorwachstums im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen, was auf eine erhöhte Wirksamkeit des PD-L1-spezifischen Moleküls hinweist. Um die funktionelle Charakterisierung von NKAB-Antikörpern in präklinischen Untersuchungen mit humanen und murinen Lymphozyten ohne den Einsatz zusätzlicher Surrogat-Moleküle zu ermöglichen, wurden im letzten Teil dieser Arbeit scFv-Antikörperdomänen entwickelt, die sowohl mit humanem als auch mit murinem NKG2D interagieren. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Harald Kolmar (TU Darmstadt) wurde hierzu eine Henne mit den extrazellulären Domänen von humanem und murinem NKG2D immunisiert. Anschließend wurde eine scFv-Antikörper-Bibliothek generiert und mittels Hefe-Oberflächen-Display einem Screening unterzogen, das zur Isolierung von vier Spezies-kreuzreaktiven Antikörperdomänen führte (bezeichnet als sc-Domänen). Nach Bestätigung ihrer hochaffinen Interaktion mit humanen und murinen NKG2D- und NKAR-Rezeptoren und der Fähigkeit, NKAR-NK-92 Zellen zu aktivieren, wurden die selektierten scFv-Fragmente in das ErbB2-spezifische NKAB-Format integriert (scNKAB-ErbB2). Im Gegensatz zu den Spezies-beschränkten hNKAB-ErbB2- und mNKAB-ErbB2-Antikörpern konnten die scNKAB-ErbB2-Moleküle die zytotoxische Aktivität sowohl von humanen als auch murinen Lymphozyten auf ErbB2-positive Tumorzellen umleiten. Weiterhin vermittelten die scNKAB-ErbB2-Moleküle in Kombination mit NKAR-NK-92 Zellen im Vergleich zu hNKAB-ErbB2 und mNKAB-ErbB2 eine stärkere Lyse von ErbB2-positiven Brustkarzinomzellen und wiesen ein breiteres therapeutisches Fenster auf. Durch die Kombination aus in silico Simulationen von Protein-Protein-Interaktionen und in vitro Bindungs-Assays in Anwesenheit einer löslichen Form des NKG2D-Liganden MICA (sMICA) wurde für zwei der vier ausgewählten sc-Domänen die Fähigkeit zur Inhibition der Interaktion von sMICA mit humanem NKG2D/NKAR nachgewiesen. Zudem zeigte sich, dass im Vergleich zu dem prototypischen hNKAB-ErbB2-Molekül, das ebenfalls bei niedrigen sMICA-Konzentrationen dessen Bindung an NKG2D/NKAR blockiert, die kompetitiven scNKAB-ErbB2-Moleküle die lytische Aktivität von hNKAR-NK-92 Zellen gegenüber ErbB2-positiven Brustkarzinomzellen in Anwesenheit von hohen sMICA-Konzentrationen effektiver aufrechterhalten. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse unterstreichen die Flexibilität des modularen NKAB-NKAR-Systems. Sowohl PD-L1-spezifische NKAB-Moleküle als auch neuartige, Spezies-kreuzreaktive Varianten konnten erfolgreich in Kombination mit NKAR-NK-92 Zellen eingesetzt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, PD-L1-spezifische NKAB-Moleküle in immunkompetenten Mausmodellen weiter zu untersuchen, in denen sowohl die Engager-Funktion der Moleküle als auch ihre Aktivität als Immun-Checkpoint-Inhibitor zum Tragen kommen. Ebenso stellen die neuen scNKAB-Moleküle mit Spezies-kreuzreaktiver Bindung an NKG2D eine vielversprechende Grundlage für die Entwicklung zukünftiger NKAB-Konstrukte dar. In Kombination mit Bindedomänen, die sowohl die humane als auch murine Variante von Tumorantigenen erkennen, wie das in dieser Arbeit verwendete PD-L1-spezifische scFv-Fragment, könnten vollständig kreuzreaktive (human/murin) Moleküle generiert werden, die eine umfassende präklinische Beurteilung der antitumoralen Aktivitäten und potenzieller Nebenwirkungen ermöglichen.