Integrating the 3R Principles into Early Toxicity Assessments – A Deep Dive into the Benefits and Challenges of Serum-Free HepG2 Cell Culture

Animal experimentation, as of today, is increasingly questioned in both the scientific community and society due to a multitude of ethical and scientific concerns. Therefore, human in vitro systems are gaining particular interest as potential replacement tools. However, as animal components are still commonly used in cell culture models, the true potential of in vitro systems as alternatives to animal testing is still compromised. Especially fetal bovine serum (FBS) is heavily used, sparking debates about the ethical and scientific defensibility of its usage in in vitro cell culture systems. Nevertheless, scientists hesitate to change their working model without solid data demonstrating the usability of serum-free cultivated cells in their desired applications. To shed light on the highly complex issue of dietary demands of cells in culture and the impact of media supplements on cellular behavior, a thorough investigation was performed based on the HepG2 cell line. This cell line is one of the major working horses in the pharmaceutical industry. It is usually utilized in early drug development to investigate the toxicity of novel drug candidates due to their ease of handling, rapid growth, and low associated costs. Different commercial media were compared for the long-term culturing capacity of HepG2 cells, with assessments focused on basic read-outs such as growth behavior, morphology, and marker expression. Front-runner media (Advanced DMEM/F12 from Thermo Fisher Scientific and TCM® Serum Replacement from MP Biomedicals) showed a long-term cultivation capacity comparable to media containing FBS and were selected for further analysis. To assess the functionality of the cells cultivated in either of the two media, HepG2 cells were treated with reference compounds specifically selected for their known hepatotoxicity characteristics in man. Different toxicological assays focusing on viability, mitochondrial toxicity, oxidative stress, and intracellular drug response were performed. The response to reference compounds was comparable throughout the different assays, with a slightly higher sensitivity of serum-free cultivated HepG2 cells when assessing viability/cell death and a lower sensitivity towards oxidative stress inducers or hypoxia-mimicking agents. To better understand the observed changes, a comparative proteomic characterization of HepG2 cells adapted to serum-free conditions alongside cells cultivated under FBS-containing conditions was performed. A particular focus was set on drug-metabolizing enzymes, NRF2-regulated proteins, and metabolic processes. Using principal component analysis and pathway analysis, nutrient-related stress and energy generation were identified as key factors for survival under serum-free conditions. Furthermore, the predicted up-regulation of multiple pathways associated with drug metabolism and oxidative stress protection was observed. Additionally, multiple antioxidative enzymes such as glutathione peroxidase and glutathione S-transferase were strongly overexpressed. Increased enzyme expression correlated with increased enzyme activity in vitro and increased glutathione peroxidase activity was linked to selenium supranutrition under serum-free conditions. Besides drug metabolism and oxidative stress response, metabolic pathways were examined more closely. In particular, lipid metabolism was strongly affected, with multiple pathways significantly up-regulated under serum-free conditions associated with fatty acid and lipid biosynthesis, lipid metabolism, and lipid transportation. Additionally, changes in glucose uptake and a strong down-regulation of the insulin and IGF1 receptor were observed, indicating fundamental changes in HepG2 metabolism. To understand the impact of these changes on cellular behavior, lipid accumulation and glucose consumption were investigated. Glucose consumption was shown to be comparable, albeit slightly higher, under serum-free conditions. In contrast, significant changes were observed when assessing intracellular lipid accumulation, with serum-free cells displaying major lipid accumulation after serum-free long-term culture. Insulin and lipids were identified as key drivers and a reduction in both supplements resulted in overall lower lipid accumulation, although remaining significantly higher compared to standard cells. To gather additional insights into the impact of lipids in HepG2 long-term culture and to remove remaining animal-derived components from the media formulation, a comparative experiment was performed using five different xeno-free media formulations with increasing complexity. Cellular growth and morphology were assessed alongside lipid accumulation and gene expression of genes involved in lipid metabolism, glucose metabolism, insulin signaling, or energy generation. By reducing the insulin concentration and supplementing media with IGF1 and the essential lipids linoleic acid and linolenic acid, intracellular lipid accumulation was significantly reduced. This allowed for the use of xeno-free cultured cells in drug-induced hepatic steatosis (DIHS) and/or phospholipidosis (DIPL) assays. Lastly, gene expression was shown to normalize significantly after adding fat-soluble antioxidants. Taken together, the generated data give insights into the impact of serum-free or xeno-free cell culture on cellular behavior and pathway regulation. In addition, this study emphasizes the need for a better understanding of the correlations between media supplementation and cell functionality. Parts of this thesis have been published previously in Pfeifer et al., 2024 and Pfeifer et al., 2025.

Tierversuche werden heute sowohl in der wissenschaftlichen Gemeinschaft als auch in der Gesellschaft zunehmend in Frage gestellt, aufgrund einer Vielzahl ethischer und wissenschaftlicher Bedenken. Menschliche in vitro Systeme gewinnen daher zunehmend an Bedeutung als potenzielle Ersatzwerkzeuge zur Verringerung oder dem Ersatz dieser. Da jedoch tierische Komponenten nach wie vor häufig in Zellkulturmodellen verwendet werden, ist das wahre Potenzial dieser Systeme bislang häufig eingeschränkt. Besonders fetales Rinderserum (FBS) wird noch immer häufig genutzt, trotz der damit verbundenen ethischen als auch wissenschaftlichen Problematik. Dennoch zögern Wissenschaftler ihr Arbeitsmodell ohne solide Daten zu ändern, die die Nutzbarkeit von serumfrei kultivierten Zellen in ihren gewünschten Anwendungen belegen. Um das hochkomplexe Thema der Ernährungsanforderungen von Zellen in Kultur und die Auswirkungen von Medienzusätzen auf das zelluläre Verhalten zu beleuchten, wurde eine Studie auf Basis der HepG2-Zelllinie durchgeführt. Diese Zelllinie ist in der pharmazeutischen Industrie weit verbreitet und wird üblicherweise in der frühen Arzneimittelentwicklung verwendet, um die Toxizität neuer Arzneimittelkandidaten zu untersuchen, da sie sich leicht handhaben lässt, schnell wächst und geringe Kosten verursacht. Verschiedene kommerzielle Medien wurden hinsichtlich der Langzeitkultivierungsfähigkeit von HepG2-Zellen verglichen, wobei die Bewertungen auf grundlegenden Parametern wie Wachstumsverhalten, Morphologie und Marker Expression basierten. Die zwei Medien mit bester Performance (Advanced DMEM/F12 von Thermo Fisher Scientific und TCM® Serum Replacement von MP Biomedicals) zeigten eine Langzeitkultivierungsfähigkeit, die mit dem FBS-haltigem Medium vergleichbar war. Weitere Experimente wurden daher mit diesen beiden Medien durchgeführt. Um die Funktionalität der serum-frei kultivierten Zellen zu bewerten, wurden HepG2-Zellen mit Referenzsubstanzen behandelt, die speziell aufgrund ihrer bekannten hepatotoxischen Eigenschaften beim Menschen ausgewählt wurden. Verschiedene toxikologische Tests wurden durchgeführt, die sich auf Zytotoxizität, mitochondriale Toxizität, oxidativen Stress sowie auf die Expression von intrazellulären Proteinmarkern konzentrierten. In den verschiedenen Tests war die Reaktion auf die Referenzsubstanzen vergleichbar, wobei eine leicht höhere Empfindlichkeit der serumfrei kultivierten HepG2-Zellen bei der Bewertung von Zytotoxizität und eine geringere Empfindlichkeit gegenüber oxidativen Stressinduktoren oder Hypoxie-imitierenden Agenzien festgestellt wurde. Um die beobachteten Veränderungen besser zu verstehen, wurde das Proteom serum-frei kultivierter HepG2 Zellen mit Zellen verglichen, die unter FBS-haltigen Bedingungen kultiviert wurden. Ein besonderer Fokus wurde hierbei auf den Arzneimittelstoffwechsel, NRF2-regulierte Proteine sowie metabolische Prozesse gelegt. Unter Verwendung der Hauptkomponentenanalyse und der Analyse von Stoffwechselwegen wurden darüber hinaus nährstoffbezogener Stress und Energieerzeugung als Schlüsselfaktoren für das Überleben unter serumfreien Bedingungen identifiziert. Weiterhin wurde eine Hochregulation mehrerer Stoffwechselwege, die mit Arzneimittelstoffwechsel und oxidativem Stressschutz verbunden sind, sowie eine starke Überexpression mehrerer antioxidativer Enzyme wie Glutathionperoxidase und Glutathion-S-Transferase beobachtet. Die erhöhte Enzymsexpression korrelierte mit einer erhöhten Enzymaktivität in vitro, und die erhöhte Aktivität der Glutathionperoxidasen wurde mit einer erhöhten Selen Konzentration unter serumfreien Bedingungen in Verbindung gebracht. Neben dem Arzneimittelstoffwechsel und der Reaktion auf oxidativen Stress wurden auch weitere Stoffwechselwege näher untersucht. Besonders der Lipidstoffwechsel war stark auffällig, mit diversen signifikant hochregulierten Stoffwechselwegen unter serumfreien Bedingungen mit Bezug zur Fettsäure- und Lipidbiosynthese, Metabolisierung und Transport. Darüber hinaus wurden Veränderungen in der Expression von Glukosetransportern, sowie eine starke Herunterregulierung des Insulin- und IGF1-Rezeptors beobachtet, was auf grundlegende Veränderungen im HepG2-Stoffwechsel hinweist. Um die Auswirkungen dieser Veränderungen auf das zelluläre Verhalten zu verstehen, wurden Lipidansammlungen und Glukoseverbrauch untersucht. Der Glukoseverbrauch erwies sich als vergleichbar, wenn auch leicht höher unter serumfreien Bedingungen. Im Gegensatz dazu wurden erhebliche Veränderungen bei der Bewertung intrazellulärer Lipidansammlungen beobachtet, wobei Zellen nach einer serumfreien Langzeitkultur erhebliche Lipidansammlungen aufwiesen. Insulin und Lipide wurden als Schlüsselfaktoren identifiziert und eine Reduzierung beider Zusätze führte insgesamt zu geringeren Lipidansammlungen, jedoch immer noch signifikant höher im Vergleich zur FBS-Kontrolle. Um zusätzliche Einblicke in die Auswirkungen von Lipiden in der HepG2-Langzeitkultur zu gewinnen und verbleibende tierische Komponenten aus der Medienformulierung zu entfernen, wurde ein Experiment mit fünf verschiedenen Medienformulierungen ohne tierische Komponenten mit zunehmender Komplexität durchgeführt. Untersucht wurden das Zellwachstum und die Morphologie, die Ansammlung von neutralen Lipiden und Phospholipiden, sowie die Expression von Genen, die am Lipid- oder Glukosestoffwechsel, der Insulin-Signalgebung oder der Energieerzeugung beteiligt sind. Durch die Reduzierung der Insulinkonzentration und die Ergänzung der Medien mit IGF1 und der essenziellen Lipiden Linolsäure und Linolensäure wurden die Lipidansammlungen signifikant reduziert, was die Verwendung in Arzneimittel-induzierten hepatischen Steatosis (DIHS) und/oder Phospholipidose (DIPL)-Tests ermöglichte. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Expression der ausgewählten Gene nach Zugabe von fettlöslichen Antioxidantien signifikant normalisiert wurde. Zusammenfassend geben die generierten Daten Einblicke in die Auswirkungen von serumfreier oder tierischer Komponenten-freier Zellkultur auf das zelluläre Verhalten und die Regulierung von Stoffwechselwegen und betonen die Notwendigkeit, die Zusammenhänge zwischen Medienzusätzen und Zellfunktionalität besser zu verstehen.