Biopolymer degradation by phagotrophic protoplast feeders (Viridiraptoridae) and associated carbohydrate-active enzymes

The heterotrophic protist Orciraptor agilis (Viridiraptoridae, Rhizaria) is a naked amoeboflagellate, which inhabits fens and bogs and feeds on dead freshwater green algae. Orciraptor exhibits mainly three different life history stages: 1) free gliding/searching for food, 2) attacking/feeding and 3) dividing/digesting. The amoeboflagellate performs a very specialized feeding strategy called protoplast feeding. After the recognition of a suitable prey cell and adhesion to the algal cell wall, Orciraptor perforates the cell wall and subsequently extracts the algal protoplast. The green algal cell wall composition differs strongly between organisms, but consists mainly of carbohydrates, like cellulose and pectins. An enzymatic degradation of the foreign cell wall would require the action of carbohydrate-active enzymes (CAZymes), as it is known for many phytopathogenic fungi, which express a large toolbox of cell wall-degrading CAZymes. A comparative transcriptome of Orciraptor revealed a large CAZyme repertoire, including an enzyme annotated as GH5_5 endocellulase. This enzyme was also the highest expressed and upregulated during the attacking stage. Furthermore, a surprisingly high number of proteins with a potential chitin-related function was found, with multiple factors being upregulated during the attacking stage. While Orciraptor’s prey is not known to utilize chitin. This thesis follows a workflow of transcriptome-informed cell biology, to substantiate indications given by the comparative transcriptome with experimental data. The following questions were addressed in this thesis: (1) Which eukaryotic and prokaryotic organisms are consumed by Orciraptor and which feeding strategies are used? (2) Is the cell wall degradation driven by enzymatic dissolution? (3) Is Orciraptor capable of producing chitinous material and what is its function? In this thesis, Orciraptor was established as broad-range, obligatory necrophage with a great flexibility concerning its feeding strategies. The broad prey range, including cells with a variety of different cell envelopes, correlates well with the diversity of CAZyme genes found in previous studies. The highest expressed enzyme was characterized and confirmed to act as endocellulase. Utilizing custom antibodies, the endocellulase was found to localise directly to the perforation zone on the algal cell wall and additionally to intracellular granules. With this, the first experimental evidence of an enzyme-driven cell wall degradation was provided. Furthermore, Orciraptor was shown to synthesize a novel, highly acetylated chitosan, which is stored in extrusomes. The chitosan polymer is likely secreted onto the algal cell wall, functioning as adhesive material during the attacking stage. Overall, the transcriptome-informed cell biology applied to the non-model protist Orciraptor elucidated fascinating aspects of the interactions of a protoplast feeder with algal cell walls.

Der heterotrophe Protist Orciraptor agilis (Virdiriraptoridae, Rhizaria) ist ein nackter Amöboflagellat, der Moore und Sümpfe bewohnt und sich von toten Süßwassergrünalgen ernährt. Orciraptor kommt zumeist in drei verschiedenen Lebensstadien vor: Freies Gleiten/Suchen nach Beute, Angreifen/Fressen und Teilen/Verdauen. Der Amöboflagellat verwendet eine sehr spezialisierte Fraßstrategien, genannt Protoplastenfressen. Nach dem Erkennen einer geeigneten Beutezelle und Anhaften an die Algenzellwand perforiert Orciraptor diese in einer schmalen Ring-Form und extrahiert anschließend den Algenprotoplasten. Der Aufbau der Algenzellwand kann zwischen Organismen sehr stark variieren, basiert aber hauptsächlich auf Kohlenhydraten wie Zellulose und Pektinen. Eine enzymatische Perforation der Zellwand benötigt den Einsatz von kohlehydrat-aktiver Enzyme (carbohydrate-active enzymes: CAZymes). Viele phytopathogene Pilze sind bekannt dafür eine große Vielfalt solcher Enzyme zu exprimieren. Ein Transkriptom von Orciraptor enthüllte eine große Anzahl von CAZymes, einschließlich eines Enzyms, das als GH5_5 Endozellulase annotiert wurde. Diese GH5_5 war zudem das am stärksten exprimierte und hochregulierte Enzym während des Attacke-Stadiums. Außerdem wurde eine überraschend große Anzahl von Proteinen mit einer potentiellen Funktion an und mit Chitin gefunden, wobei mehrere Faktoren auch während des Attacke-Stadiums hochreguliert wurden. Interessanterweise enthält die natürliche Beute von Orciraptor kein Chitin. In dieser Thesis werden die Hinweise aus dem Transkriptom mit zellbiologischen Methoden untersucht und mit experimentellen Daten untermauert (Transkriptom-informierte Zellbiologie). Folgenden Fragen werden in dieser Thesis bearbeitet: (1) Welche eukaryotischen und prokaryotischen Organismen frisst Orciraptor und welche Fraßstrategien wendet er an? (2) Wird die Algenzellwand enzymatisch verdaut und ist die potentielle Endozellulase tatsächlich aktiv auf Zellulose? (3) Produziert Orciraptor chitinhaltiges Material und welche Funktion erfüllt es während des Attacke-Stadiums? In dieser Thesis wurde Orciraptor als obligatorischer algenfressender Nekrophage bestätigt und es wurde eine große Flexibilität von angewandten Fraßstrategien festgestellt. Das große Beutespektrum und die damit einhergehende Varianz an Zellhüllen korreliert mit dem großen Arsenal von CAZymes. Das am stärksten exprimierte Enzym wurde charakterisiert und als Endozellulase bestätigt. Mithilfe von spezifischen Antikörpern wurde festgestellt, dass die Endozellulase direkt in die Perforationszone auf der Algenzellwand und zusätzlich in intrazellulären körnchenartigen Strukturen lokalisiert. Mit dieser Studie wurde der erste experimentelle Beweis für eine enzym-getriebene Zellwandperforation in Protoplastenfressern geliefert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orciraptor intrazellulär ein neues, stark acetyliertes Chitosan synthetisiert, welches dann in Extrusomen gespeichert wird. Das Chitosanpolymer wird wahrscheinlich auf die Algenzellwand sezerniert und dient als Adaptermaterial für Orciraptor während des Perfortionsvorgangs. Insgesamt zeigte sich der Arbeitsablauf der Transkriptom-informierten Zellbiologie als wertvollen Arbeitsablauf für die Analyse von Interaktionen von einem Nicht-Modellorganismus wie Orciraptor mit Algenzellwänden.