Development of human brain tumor assembloids that mimic the interaction of normal and tumorous tissue to assess the impact of ionizing radiation

Although brain and other central nervous system (CNS) cancers are relatively rare, they have a high mortality rate [1] despite treatment with surgery, chemotherapy, and/or radiation therapy [2–5]. To further improve therapeutic approaches and to diminish the lethality of patients with brain and other CNS cancers, it is crucial to understand the treatment-induced cellular and molecular alterations in both normal brain and tumorous tissues, as well as their interactions. For this purpose, the main objective of this thesis was to generate a three-dimensional human cell culture model that simulates brain tumors, including early tumorigenesis, and that is suitable for investigating radiation-induced effects exerted on normal and tumorous brain tissue as well as their interaction. The brain tumor assembloid model generated in this thesis consisted of two connected parts with the same genetic background: the normal neural tissue was modeled using neural spheroids generated from human embryonic stem cells (hESCs), and the tumor-like tissue was modeled using genetically modified MYC overexpressing (MYCOE) cells, which were generated in an autologous setting from neural spheroids. Tumor initiation and promotion were simulated by overexpression of the oncogene MYC [6], which was stably integrated into the genome of single cells of the neural spheroid, and by the proliferation of these MYCOE cells within the neural spheroid thereafter. To balance the physiological cellular and morphological heterogeneity observed in vivo with the cellular and morphological similarity of replicate samples across experiments, a heterogeneous MYCOE cell population was isolated, aggregated into uniform spheres (MYCOE spheres), and fused with normal d100 neural spheroids, containing neuronal and glial cells, to simulate the tumor-like part of the generated brain tumor assembloid model. The proliferating MYCOE cells showed an immature neural phenotype, lower expression of tumor suppressor genes, as well as infiltrative and metastatic characteristics. In the assembloids, astrocytes from the neural spheroids extended their branches into the bordering MYCOE spheres and enveloped the infiltrated MYCOE cells within the neural spheroid. The assembloids are suitable for analyzing and interpreting radiation therapy effects using, for example, X-ray irradiation. Exposition of 1 or 3 Gy X-rays resulted in increased extend of MYCOE cell death, a lower number of infiltrating MYCOE cells, and shorter infiltration depth. The model bridges the gap between different model systems, is adaptable to specific tumor features, and offers a suitable possibility for human brain tumor modeling. A schematic overview of the brain tumor assembloid generation is shown in Figure 1.

Obwohl Krebserkrankungen des Gehirns und anderer Teile des zentralen Nervensystems (ZNS) relativ selten sind, weisen sie trotz chirurgischer, chemotherapeutischer und/oder strahlentherapeutischer Behandlung [2–5] eine hohe Mortalität auf [1]. Um die therapeutischen Ansätze weiter zu verbessern und die Sterblichkeit von Patienten mit Gehirn- und andere ZNS-Krebserkrankungen zu verringern, ist das Verständnis der behandlungsbedingten zellulären und molekularen Veränderungen sowohl im normalen Gehirngewebe als auch im tumoröse Gewebe sowie deren Wechselwirkungen von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grund war das Hauptziel dieser Arbeit die Generierung eines dreidimensionalen humanen Zellkulturmodels zur Simulation von Gehirntumoren, einschließlich der frühen Tumorgenese, das für die Untersuchung strahleninduzierten Auswirkungen auf normales und tumoröses Gehirngewebe sowie deren Interaktion geeignet ist. Das in dieser Thesis generierte Gehirntumor-Assembloid-Modell bestand aus zwei miteinander verbundenen Teilen mit demselben genetischen Hintergrund: Das normale neurale Gewebe wurde mit neuralen Sphäroiden modelliert, welche aus humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) generiert wurden, und das tumorähnliche Gewebe wurde mit genetisch veränderten MYC überexprimierenden (MYCOE) Zellen modelliert, die in einem autologen System aus neuralen Sphäroiden generiert wurden. Die Tumorinitiation und promotion wurde durch die erlangte Überexpression des Onkogens MYC [6] simuliert, welches stabil in das Genom einzelner Zellen des neuralen Sphäroids integriert wurde, und durch die anschließende Proliferation dieser MYCOE Zellen innerhalb des neuralen Sphäroids. Um die in vivo beobachtete physiologische zelluläre und morphologische Heterogenität und die zelluläre und morphologische Ähnlichkeit der Replikatproben in den verschiedenen Experimenten auszugleichen, wurde eine heterogene MYCOE Zellpopulation isoliert, zu gleichförmigen Sphären (MYCOE Sphären) aggregiert und mit normalen d100 neuralen Sphäroiden fusioniert, welche neuronale und gliale Zellen enthalten, um den tumorähnlichen Teil des generierten Gehirntumor-Assembloid-Modell zu simulieren. Die proliferierenden MYCOE Zellen wiesen einen unreifen neuralen Phänotyp, eine verminderte Expression von Tumorsuppressorgenen sowie infiltrative und metastatische Eigenschaften auf. In den Assembloiden erweiterten Astrozyten aus den neuralen Sphäroiden ihre Ausläufer in die angrenzenden MYCOE Sphären und umgaben die infiltrierten MYCOE Zellen innerhalb der neuralen Sphäroide. Die Assembloide eignen sich für die Analyse und Interpretation von Strahlentherapieeffekten, durch beispielsweise Röntgenbestrahlung. Die Bestrahlung mit 1 oder 3 Gy Röntgenstrahlung führte zu einem vermehrten Absterben der MYCOE Zellen, einer verringerten Anzahl infiltrierender MYCOE Zellen und einer kürzeren Infiltrationstiefe. Das Modell überbrückt die Lücke zwischen verschiedenen Modellsystemen, ist an spezifische Tumormerkmale anpassbar und stellt eine effektive Möglichkeit zur Modellierung menschlicher Gehirntumore dar. Ein schematischer Überblick über die Erstellung des Gehirntumormodells ist in „Figure 1” dargestellt.