Conditionally Activated Cytosol-Penetrating Antibodies and Peptides for Cell-Specific Intracellular Cargo Delivery

Monoclonal antibodies and their bispecific variants have demonstrated efficacy in diagnostic and therapeutic applications in various fields over the past decades, including autoimmune diseases, cancer, and infectious diseases. However, the targeting of tumor-associated antigens by high-affinity antibodies is typically confined to surface-exposed or secreted proteins, despite the fact that the majority of disease-related altered protein-protein interactions occur in the cytosol. Antibodies that are capable of overcoming the cell membrane barrier and accumulating in the cytosol are classified as cytosol-penetrating antibodies. In the majority, cell binding occurs through electrostatic interactions with the extracellular matrix, leading to a typically non-specific process of cytosol penetration. The present work is focused on the establishment of detection methods for the verification of cytosolic transport of proteins and peptides, as well as the generation and characterization of conditionally activatable, tumor cell-specific, cell-penetrating peptides and antibodies. The initial study in this cumulative work aimed to characterize a conditionally activatable, cytosol-penetrating antibody, in the following referred to as CPAb, and to compare it with the well-known cytosol-penetrating antibody cytotransmab. First, the function and relevance of the HSPG binding motif for the binding of the unmasked CPAb on target cells and the subsequent internalization were verified. The cytosol-penetrating capabilities of the CPAbs were demonstrated by two orthogonal detection methods resulting in cytosol penetration rates that were either similar to or higher than those observed with cytotransmab. The detection methods were based on a fragmented luciferase and a truncated variant of the catalytic domain of Pseudomonas exotoxin A. An immune library derived from an immunized chicken was employed, utilizing yeast surface display (YSD) in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS), to facilitate the sorting and isolation of affinity binders directed against the binding domain of scFv-formatted CPAb, thereby enabling the generation of affinity-based masking units. The generation of two masked and conditionally activatable CPAb variants was achieved by the N-terminal attachment of the masking units to the light chain of the antibody via a cleavable linker sequence. This linker sequence was designed to be cleaved in the tumor microenvironment (TME) by the insertion of a recognition sequence of the in TME overexpressed matrix metalloprotease-9 (MMP-9). The inhibitory function of the mask on binding and internalization, as well as its influence on cytosol-penetrating properties, were investigated and confirmed through fluorescence labeling and cytosol penetration assays in vitro. The cleavage of the mask resulted in the complete regeneration of the cytosol-penetrating properties. The masked CPAb variant represents the first masked, cytosol-penetrating antibody whose capacity for cytosolic translocation, in the function of a transport protein for cargo proteins, can be simultaneously conditionally activated in the TME. The second investigation was conducted with the objective of generation and characterization of tumor cell-specific and cell-penetrating antibodies, based on the previously generated masked CPAb variant. Three distinct bispecific antibodies were engineered through the utilization of the "knobs-into-holes" methodology, with the masked CPAb positioned on one arm and a tumor-associated antigen (TAA) binding antibody fragment on the second arm. To facilitate the release of the antibody from the receptor following clathrin-mediated endocytosis, an additional furin cleavage site was inserted between the TAA-binding antibody fragment (anti-HER2, anti-B7-H3 and anti-CD22) and the hinge region. The specific binding of the respective TAA-overexpressing cells was verified for all constructs, and significantly improved binding properties were demonstrated in comparison with the native CPAb. The results of the binding and internalization assays also supported the hypothesis of predominantly TAA-mediated binding and endocytosis of the constructs. The investigation of the cytosol-penetrating properties of the bispecific constructs has led to the verification of the relevance of the endosomal furin cleavage site, as well as the tumor specificity of the constructs. It is noteworthy that constructs lacking prior cleavage of the masking unit were unable to penetrate the cytosol despite internalization, indicating that the inhibitory function of the mask is also preserved in the acidic environment of the endosomes. This study presents the first modular approach for TAA-specific intracellular transport of cargo proteins into tumor cells, simultaneously enabling cytosolic translocation conditioned upon activation in the TME. The third project focused on the investigation of tumor cell-specific cell penetration using an antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) approach. The cell-penetrating peptide L17E was masked by the attachment of enzyme-cleavable acetyl protecting groups to the lysines of the peptide. The resulting inhibitory effect on cell penetration was then analyzed and the regeneration of cell penetration following incubation with the deacetylase SIRT2 was confirmed in different studies. To conditionally activate the masked peptide-cryptophycin conjugates in tumor cells, antibodies (trastuzumab and anti-B7-H3) were conjugated with SIRT2. Finally, the penetration of the cytosol with and without antibody-SIRT2 conjugate was tested in various cell lines through cell proliferation analysis. The studies demonstrated the feasibility of antibody-mediated peptide deacetylation as well as the potential for achieving conditionally activatable and TAA-specific cell penetration. The project thus represents the first approach for the SIRT2-dependent generation of conditionally activatable, cell-penetrating peptides using an ADEPT-like approach for TAA-specific cargo transport. Such as antibody fragments, peptides with a potential therapeutic effect can be sorted for affinity binders in a high-throughput process utilizing YSD in conjunction with FACS. In the case of highly structured peptides, such as cystine knots comprising three structure-determining disulfide bridges, a rational design of the peptide library is essential to obtain the three-dimensional structure and, consequently, the formation of the binding-relevant loops. In the last project, the methodology of YSD, as well as the subsequent peptide synthesis and binding studies, were described in detail. The step-by-step procedure can be systematically applied to the generation and identification of affinely structured peptides with partially conserved amino acid sequence for the inhibition or binding of antigens.

In den vergangenen Jahrzehnten haben monoklonale Antikörper sowie deren bispezifische Varianten in der diagnostischen und therapeutischen Anwendung in verschiedenen Bereichen, darunter Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten, ihre Effektivität unter Beweis gestellt. Die Adressierung von tumorassoziierten Antigenen durch hochaffine Antikörper ist jedoch in der Regel auf oberflächenpräsentierte oder sekretierte Proteine beschränkt, ungeachtet der Tatsache, dass der Großteil der krankheitsbedingt veränderten Protein-Protein-Interaktionen im Zytosol stattfindet. Antikörper, welche die Barriere der Zellmembran überwinden und im Zytosol akkumulieren können, gehören zur Klasse der zytosolpenetrierenden Antikörper. In den meisten Fällen erfolgt die Bindung an Zellen durch elektrostatische Interaktionen mit der extrazellulären Matrix, wodurch der Prozess der Zytosolpenetration in der Regel unspezifisch ist. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung von Nachweismethoden zur Verifizierung des zytosolischen Transports von Proteinen und Peptiden sowie der Generierung und Charakterisierung von konditionell aktivierbaren und tumorzellspezifisch zellpenetrierenden Peptiden und Antikörpern. Die erste Studie im Rahmen der vorliegenden kumulativen Arbeit hatte zum Ziel, einen konditionell aktivierbaren, zytosolpenetrierenden Antikörper, im Folgenden als CPAb bezeichnet, zu charakterisieren und mit dem gut erforschten ebenfalls zellpenetrierenden Antikörper Cytotransmab zu vergleichen. Zunächst konnte die Funktion und Relevanz des HSPG-Bindemotives zur Bindung des unmaskierten CPAb an Zielzellen und die anschließende Internalisierung verifiziert werden. Die zytosolpenetrierenden Fähigkeiten des CPAbs wurden über zwei orthogonale Nachweismethoden nachgewiesen und im Vergleich zum Cytotransmab ähnliche bis höhere Zytosolpenetrierungsraten beobachtet. Die Nachweismethoden basierten auf einer fragmentierten Luciferase und einer verkürzten Variante der katalytischen Domäne des Pseudomonas Exotoxin A. Eine von einem immunisierten Huhn stammende Immunbibliothek wurde unter Verwendung von Hefeoberflächendisplay (eng. „yeast surface display“, YSD) in Verbindung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (eng. „fluorescence-activated cell sorting“, FACS) eingesetzt, um die Sortierung und Isolierung von Affinitätsbindern gegen die Bindungsdomäne von scFv-formatiertem CPAb zu ermöglichen, wodurch affinitätsbasierte Maskierungseinheiten generiert wurden. Die Generierung zweier maskierter und konditionell aktivierbarer CPAb-Varianten erfolgte durch die N-terminale Fusion der Maskierungseinheiten an die leichte Kette des Antikörpers über spaltbare Linker. Die Linker-Sequenz wurde für die Spaltung im Tumorgewebe konzipiert, wobei durch die Insertion einer Erkennungssequenz die in der Tumormikroumgebung (TME) überexprimierte Matrix-Metalloprotease-9 adressiert wird. Die inhibierende Funktion der Maske auf Bindung und Internalisierung sowie deren Einfluss auf die zytosolpenetrierenden Eigenschaften wurden mittels Fluoreszenzmarkierung sowie Tests zur Zytosolpenetrierung untersucht und bestätigt. Die Abspaltung der Maske resultierte in einer Regeneration der zytosolpenetrierenden Eigenschaften. Die maskierte CPAb-Variante stellt den ersten zellpenetrierenden Antikörper dar, der konditionell im TME aktivierbar ist und als Transporter für ein angekoppeltes Protein wirkt. Im Rahmen der zweiten Untersuchung erfolgte die Generierung und Charakterisierung von tumorzellspezifisch zellpenetrierenden Antikörpern, welche auf der zuvor generierten, maskierten CPAb-Variante basieren. Im Folgenden wurden nach der "knobs-into-holes"-Technik drei verschiedene bispezifische Antikörper konzipiert, die auf einer Seite den maskierten CPAb tragen und auf der anderen Seite eine Bindedomäne, die spezifisch ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) erkennt. Um die endosomale Freisetzung des Antikörpers von dem Rezeptor nach Clathrin-vermittelter Endozytose zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine Furin-Spaltstelle zwischen dem TAA-bindenden Antikörperfragment (anti-HER2, anti-B7-H3 und anti-CD22) und der konstanten Region des Antikörpers eingefügt. Die spezifische Bindung an die jeweiligen TAA-überexprimierenden Zellen konnte für alle Konstrukte verifiziert und zusätzlich signifikant verbesserte Bindungs- und Internalisierungseigenschaften nachgewiesen werden. Die Ergebnisse von Bindungs- und Internalisierungsanalysen stützen zudem die These der hauptsächlich TAA-vermittelten Bindung und Endozytose der Konstrukte. Die Untersuchungen zu den zytosolpenetrierenden Eigenschaften der bispezifischen Konstrukte zeigten die Relevanz der endosomalen Furin-Spaltstelle sowie deren Tumorspezifität. Bemerkenswerterweise konnte gezeigt werden, dass Konstrukte ohne vorherige Abspaltung der maskierenden Einheit trotz Internalisierung nicht in das Zytosol penetrierten, was darauf hinweist, dass die inhibierende Funktion der Maske auch im azidischen Milieu der Endosomen gewährleistet ist. Diese Studie demonstriert den ersten, modularen Ansatz zum TAA-spezifischen, intrazellulären Transport von Cargo-Proteinen in Tumorzellen, welcher gleichzeitig eine nur im TME konditionell aktivierbare zytosolische Translokation ermöglicht. Das dritte Projekt fokussierte sich auf die Untersuchung der tumorzellspezifischen Zellpenetration durch einen ADEPT (von engl. "antibody-directed enzyme prodrug therapy") ähnlichen Ansatz. Das zellpenetrierende Peptid L17E wurde hierfür durch die Anbringung von enzymspaltbaren Acetyl-Schutzgruppen an den Lysinen des Peptids maskiert und deren resultierender inhibierender Effekt auf die Zellpenetration analysiert. Die Regenerierung der Zellpenetration nach Inkubation mit der Deacetylase SIRT2 konnte in verschiedenen Untersuchungen bestätigt werden. Zur konditionellen Aktivierung der maskierten Peptid-Cryptophycin-Konjugate in Tumorzellen wurden Antikörper (Trastuzumab und anti-B7-H3) mit SIRT2 konjugiert und die Zytosolpenetration mit und ohne Antikörper-SIRT2-Konjugat in verschiedenen Zelllinien über die Zellproliferation getestet. Im Rahmen der Untersuchungen konnte zum einen die Antikörperkonjugat-vermittelte Deacetylierung des Peptids sowie die konditionell aktivierbare und TAA-spezifische Zellpenetration des Peptids nachgewiesen werden. Das Projekt stellt somit den ersten Ansatz zur Generierung von, durch SIRT2 konditionell aktivierbaren, zellpenetrierenden Peptiden über einen ADEPT-ähnlichen Ansatz zum TAA-spezifischen Cargo-Transport dar. Peptide mit potentiell therapeutischer Wirkung können ebenso wie Antikörperfragmente über einen Hochdurchsatz Prozess mittels YSD in Kombination mit FACS nach affinen Bindern sortiert werden. Für hochstrukturierte Peptide, wie Cystin-Knoten mit drei strukturbestimmenden Disulfidbrücken, ist ein rationales Design der Peptid-Bibliothek notwendig, um die 3D Struktur und somit die Ausbildung der bindungsrelevanten Schleifen zu erhalten. In dem letzten Projekt wurde die Methodik des YSD, als auch anschließende Peptidsynthese und Bindungsstudien im Detail beschrieben. Die schrittweise Anleitung kann systematisch auf die Generierung und Identifizierung von affinen, hochstrukturierten Peptiden mit teils konservierter Aminosäuresequenz zur Inhibition oder Bindung von Antigenen angewendet werden.