Genome Replication Progression and Epigenetic Regulation in Mammalian Cells

Among all mammalian cellular organelles, the nucleus gets special attention as it contains the genetic information of the cell, the DNA. This is also the site where all DNA-dependent functions, such as genome duplication prior to cell division, DNA transcription, and damage repair upon various DNA breakages undergo. The nucleus also contains the subcompartment, an assembly site for the ribosome, the nucleolus. Among all the DNA-templated events, genome duplication is the most eventful, involving a large array of proteins simultaneously unwinding and synthesizing a new pair of DNA at thousands of locations of the same long polymer, yet tightly regulated in time and space. It is an event on a scale hitherto undreamt of. While the faithful reconstitution of cellular identity involves the accurate inheritance of epigenetics, the information that sits atop the genetic information, the dynamic nature of epigenetics also influences the chromatin structure and regulates various aspects of DNA-templated events, including genome replication programs. The progression of development also triggers changes in the epigenetic landscape, thereby influencing the replication program. During genome replication, the chromatin decondenses, the DNA unwinds, and new DNA is synthesized and rewrapped around the histone core. The spatio-temporal regulation of the replication program also ensures the faithful inheritance of the epigenetic nature, specifically the histone post-translational modifications. However, the intricate interplay between epigenetics and the genome replication program remains a mystery, awaiting further exploration.
The present work first sheds light on the developmental changes in genome replication programs, features of replication forks, and underlying chromatin dynamics in human cells. It also uncovered the change in replication time of less-studied tandem and interspersed repeats, which constitute a large chunk of the genome, using repli-FISH. As a prerequisite, a novel approach to analyze the repli-FISH was developed. A switch in the replication timing of ribosomal DNA and differential replication program of Alu, LINE1, and Centromere were observed. Interactions between genome replication machinery and RNA polymerase I responsible for rDNA transcription were observed in pluripotent stem cells. Overall, the study also complements and expands our understanding of the developmentally regulated genome replication program in human cells. High-throughput image analysis was used to quantify the histone modification marks in different cell cycle phases to characterize the relationship between genome replication and epigenetics. Furthermore, the statistical tool nucim was used to map the dynamic localization of histone marks to different compaction classes with cell cycle and sub-S phase progression in pluripotent stem cells. Dynamic localization in constitutive heterochromatin and its replication timing regulation by H3K36me3 was unveiled. Furthermore, genome-wide dynamics of H3K27me3 and H3K4me3, which also mark the poised/bivalent chromatin in embryonic stem cells, unveiled a peculiar pattern. Using synthetic biology, the replication program was disrupted by localizing the constitutive heterochromatin next to nuclear lamin, and its effect on epigenetics was studied. Furthermore, the earliest replication origins and their (epi)genetic/chromatin characteristics are explored to validate the Domino model of replication progression. The approach to finding the cells with the earliest origins is developed in living and fixed cells was established for a detailed exploration. The ribosomal DNA tandem repeat was discovered as one of the preferred locations to start the replication across mammalian cell lines/species. To investigate the genetic nature of these origins, methods to identify, collect, and amplify single-cell genomes linearly were established to measure the micro-copy number gain. Finally, a model was presented describing the genome replication progression and interaction of epigenetic and replication programs.

Unter allen zellulären Organellen von Säugetieren erhält der Zellkern besondere Aufmerksamkeit, da er die genetische Information der Zelle, die DNA, enthält. Er ist auch der Ort, an dem alle DNA-abhängigen Prozesse stattfinden, wie die Genomduplikation vor der Zellteilung, die Transkription der DNA und die Reparatur von DNA-Schäden durch verschiedene Brüche. Der Zellkern enthält zudem ein Subkompartiment, den Nukleolus, der als Assemblierungsort für Ribosomen dient. Unter den DNA-abhängigen Prozessen ist die Genomduplikation die ereignisreichste: Sie umfasst eine Vielzahl von Proteinen, die gleichzeitig die DNA an Tausenden von Stellen eines langen Polymers entwirren und eine neue DNA-Doppelhelix synthetisieren – ein zeitlich und räumlich streng reguliertes Ereignis von bisher unvorstellbarem Ausmaß.

Während die getreue Wiederherstellung der zellulären Identität die präzise Vererbung epigenetischer Informationen – jener Informationen, die über den genetischen Informationen liegen – erfordert, beeinflusst die dynamische Natur der Epigenetik auch die Chromatinstruktur und reguliert verschiedene Aspekte der DNA-abhängigen Prozesse, einschließlich der Programme der Genomreplikation. Die Entwicklung eines Organismus löst zudem Veränderungen in der epigenetischen Landschaft aus, die wiederum das Replikationsprogramm beeinflussen. Während der Genomreplikation dekondensiert das Chromatin, die DNA wird entwunden, und neue DNA wird synthetisiert und erneut um die Histonkerne gewickelt. Die räumlich-zeitliche Regulation des Replikationsprogramms gewährleistet auch die getreue Vererbung der epigenetischen Eigenschaften, insbesondere der posttranslationalen Modifikationen der Histone. Dennoch bleibt das komplexe Zusammenspiel zwischen Epigenetik und dem Genomreplikationsprogramm ein Rätsel, das weitere Erforschung erfordert.

Die vorliegende Arbeit beleuchtet zunächst die entwicklungsbedingten Veränderungen in den Genomreplikationsprogrammen, die Eigenschaften von Replikationsgabeln und die zugrunde liegende Chromatindynamik in menschlichen Zellen. Mithilfe von Repli-FISH wurde zudem eine Veränderung der Replikationszeit weniger erforschter tandemartiger und verstreuter Wiederholungssequenzen, die einen großen Teil des Genoms ausmachen, untersucht. Im Vorfeld wurde ein neuartiger Ansatz zur Analyse von Repli-FISH entwickelt. Dabei wurden ein Wechsel im Replikationszeitpunkt ribosomaler DNA sowie unterschiedliche Replikationsprogramme von Alu-, LINE1- und Zentromer-Wiederholungen beobachtet. In pluripotenten Stammzellen konnten Interaktionen zwischen der Genomreplikationsmaschinerie und der RNA-Polymerase I, die für die Transkription ribosomaler DNA verantwortlich ist, nachgewiesen werden. Insgesamt ergänzt und erweitert die Studie unser Verständnis der entwicklungsregulierten Genomreplikationsprogramme in menschlichen Zellen.

Hochdurchsatz-Bildanalysen wurden eingesetzt, um Histonmodifikationen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu quantifizieren und die Beziehung zwischen Genomreplikation und Epigenetik zu charakterisieren. Zusätzlich wurde das statistische Tool nucim verwendet, um die dynamische Lokalisierung von Histonmodifikationen in verschiedenen Kompaktionsklassen während des Zellzyklus und des Sub-S-Phasen-Fortschritts in pluripotenten Stammzellen zu kartieren. Dabei wurde eine dynamische Lokalisierung im konstitutiven Heterochromatin sowie dessen Replikationszeitregulation durch H3K36me3 aufgedeckt. Darüber hinaus wurden genomweite Dynamiken von H3K27me3 und H3K4me3, die auch das poised/bivalente Chromatin in embryonalen Stammzellen markieren, in einem auffälligen Muster dargestellt. Mithilfe der synthetischen Biologie wurde das Replikationsprogramm durch die Lokalisierung des konstitutiven Heterochromatins in die Nähe der Kernlamina gestört, und die Auswirkungen auf die Epigenetik wurden untersucht.

Ferner wurden die frühesten Replikationsursprünge sowie deren (epi-)genetische und chromatinbezogene Merkmale untersucht, um das Domino-Modell der Replikationsprogression zu validieren. Ein Ansatz, um lebende und fixierte Zellen mit den frühesten Ursprüngen zu identifizieren, wurde etabliert, um eine detaillierte Untersuchung zu ermöglichen. Es wurde festgestellt, dass ribosomale DNA-Tandemwiederholungen bevorzugte Startpunkte für die Replikation in Säugetierzelllinien und -arten darstellen. Um die genetische Natur dieser Ursprünge zu untersuchen, wurden Methoden entwickelt, um Einzelzellgenome linear zu identifizieren, zu sammeln und zu amplifizieren, um mikro-kopienzahlenabhängige Gewinne zu messen.

Abschließend wurde ein Modell vorgestellt, das die Progression der Genomreplikation und die Interaktion zwischen epigenetischen und Replikationsprogrammen beschreibt.