Impact of S-sulfocysteine on Chinese hamster ovary cells

In the biopharmaceutical industry, Chinese hamster ovary (CHO) cells are the primary workhorse for therapeutic protein production (monoclonal antibodies, fusion proteins) in large-scale processes — constantly undergoing optimization to increase the product yield. In this context, optimized cell culture media and feeds are critical and often rely on cysteine (Cys) analogues to overcome the Cys-related stability and solubility issues at neutral pH. Previously, the Cys analogue, S-sulfocysteine (SSC), was successfully applied in cell culture, implying the SSC uptake, metabolization and biological activity, though the latter have not yet been characterized thoroughly. Furthermore, SSC also demonstrated a concentration-dependent toxicity in cells. Therefore, the present study sought to investigate the SSC metabolism and activity in more detail to provide an enhanced understanding and knowledge surrounding its beneficial, non-toxic and toxic characteristics. In the first part of the study, the CHO-K1 model clone was investigated in the presence of SSC at a non-toxic concentration to understand its metabolism/activity, and underlying mechanism(s) of action. Therefore, a CHO-K1-based fed-batch process (+ pH control), multi-omics and mechanistic approaches were performed, pointing out the following hallmarks: (1) SSC/glutathione (GSH) mixed disulfide formation, (2) glutaredoxin 1- and glutathione reductase (GR)-conveyed reduction and (3) sulfur species liberation, followed by their diversion towards catabolic pathways. The SSC-derived molecules, GSH, taurine and sulfite, were identified as those that are most likely conferring the favorable activity via their antioxidant and protective roles. In the second part of the study, the CHO-K1 clone was examined using SSC at toxic concentrations to understand the mechanism(s) of toxicity. The CHO-K1 fed-batch process (± pH control) pointed to the SSC toxicity in the pH- surrounding that correlated with an extracellular pH decrease — likely reflecting an intracellular pH drop. The sulfo-glutathione (GS-SO3) mixed disulfide reduction, particularly the GR-conveyed GSH recycling, was strongly hampered at lower pH levels in vitro. Complementary to these findings, CHO-K1 cells experienced an aggravated SSC toxicity upon a GSH decrease triggered by buthionine sulfoximine, while control cells (without SSC treatment) remained vital. These results underline the importance of GSH, though its deficit appeared not to be solely driving the toxicity. Intensified SSC toxicity further correlated with a hindered GS-SO3 reduction and export. Mitigation strategies to prevent the SSC toxicity through the addition of sodium carbonate, sodium glutamate and copper (II) sulfate to the feed were successful. In the third part of the study, the CHO-K1, CHOZN and CHO-DG44 clones, exhibiting phenotypic heterogeneity, were explored using SSC at wide-ranging doses to provide complementary data. The CHO-DG44 clone showed the lowest SSC sensitivity that was linked to a putative lower SSC uptake capacity, as well as a higher reactive sulfur and oxygen species scavenging capacity. This SSC-related knowledge regarding its dual nature paves the way for further research, and may be transferred to other clones that may respond differently to this modified amino acid.

In der biopharmazeutischen Industrie werden bevorzugt Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) für die Produktion therapeutischer Proteine (monoklonale Antikörper, Fusionsproteine) in großtechnischen Prozessen eingesetzt, die zur Erhöhung der Produktausbeute stetigen Optimierungen unterliegen. In diesem Zusammenhang sind optimierte Zellkulturmedien und Feeds von entscheidender Bedeutung. Diese beinhalten oftmals Cystein (Cys) Derivate, um die Cys-bedingten Stabilitäts- und Löslichkeitsprobleme bei neutralem pH zu umgehen. Das Cys Derivat, S-Sulfocystein (SSC), wurde bereits erfolgreich in Zellkulturen angewendet. Die Erkenntnisse der Studien deuten auf die SSC Aufnahme, Metabolisierung und letztendlich dessen biologische Aktivität hin, wobei letztere noch nicht hinreichend charakterisiert wurden. Weiterhin zeigte SSC ebenfalls eine konzentrationsabhängige Toxizität in Zellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung von SSC hinsichtlich des Metabolismus und der Aktivität, um ein tieferes Verständnis für den vorteilhaften, nicht-toxischen und toxischen Charakter zu erlangen. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung von CHO-K1 als Modellklon bei nicht-toxischen SSC Konzentrationen, um Einblicke in den Metabolismus, seine Aktivität und die zugrunde liegenden Mechanismen zu gewinnen. Hierzu wurden CHO-K1-basierte Fed-Batch Prozesse (+ pH Kontrolle), Multi-Omics und mechanistische Untersuchungen durchgeführt. Die CHO-spezifischen Daten deuten dabei auf (1) eine Interaktion zwischen SSC und Glutathion (GSH) hin mit anschließender Bildung von "gemischten" Disulfiden, (2) deren Reduktion durch das Glutaredoxin 1 und Glutathion-Reduktase (GR) Enzymsystem und (3) die damit verbundene Freisetzung von Schwefelspezies, die in weiteren zellulären Prozessen metabolisiert werden. Unter den von SSC stammenden Molekülen wurden GSH, Taurin und Sulfit aufgrund ihrer antioxidativen and schützenden Wirkung als Schlüsselmetabolite für die SSC Aktivität angesehen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung des CHO-K1 Klons bei toxischen SSC Konzentrationen, um den grundlegenden Mechanismus der Toxizität zu verstehen. Der Fed-Batch Prozess (± pH Kontrolle) deutete auf die SSC-bedingte Toxizität unter nicht pH-kontrollierten Bedingungen hin, die mit einer Erniedrigung des extra- und vermutlich auch des intrazellulären pH Wertes einherging. Der Abbau von Sulfo-Glutathion (GS-SO3), speziell das Recycling von GSH durch GR, zeigte eine starke Beeinträchtigung bei niedrigeren pH Werten in vitro. Ergänzend dazu wurden CHO Zellen einer verstärkten SSC Toxizität bei einer durch Buthioninsulfoximin ausgelösten GSH Verknappung ausgesetzt, wobei die Kontrollzellen (ohne SSC Behandlung) unversehrt blieben. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung von GSH, wobei der GSH Mangel als alleinige treibende Kraft für die toxischen Effekte ausgeschlossen wurde. Zudem ging die verstärkte SSC Toxizität sowol mit einer Beeinträchtigung des GS-SO3 Abbaus als auch mit einem beeinträchtigten Export einher. Strategien zur Vermeidung der Toxizität durch Zugabe von Natriumcarbonat, Natriumglutamat und Kuper(II)-sulfat zum Feed waren erfolgreich. Der dritte Teil der Arbeit zielte darauf ab, die bisherigen Erkenntnisse von CHO-K1 mittels der beiden CHOZN und CHO-DG44 Klone mit phänotypischer Heterogenität zu ergänzen. Der CHO-DG44 Klon zeigte die geringste Empfindlichkeit gegenüber SSC, die wiederrum mit einer vermeintlich geringeren Kapazität zur SSC Aufnahme und einer erhöhten Kapazität zur Eliminierung von reaktiven Schwefel- und Sauerstoffspezies verbunden war. Diese SSC-relevanten Informationen hinsichtlich der komplexen Natur ebnen den Weg für weiterführende Forschungen, und können auch auf andere Klone übertragen werden, die eventuell auf die modifizierte Aminosäure unterschiedlich reagieren.