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Identification and characterization of esterases involved in the conversion of oleosides in Olea europaea

Volk, Jascha :
Identification and characterization of esterases involved in the conversion of oleosides in Olea europaea.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2019)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Identification and characterization of esterases involved in the conversion of oleosides in Olea europaea
Language: English
Abstract:

Since the epidemiological long-term survey of the ‘Seven Countries Study’, olive oil as a health-promoting food has gained increasing attention in pharmacological research. In this context, there was a particular interest in the so-called olive polyphenols, including the secoiridoid derivatives oleocanthal and oleacein, the regular intake of which has been associated with a protective effect against cancer as well as cardiovascular and neurodegenerative diseases. Both substances can be detected in relatively high concentrations in virgin olive oil, whereas they are usually not detectable in intact fruits or leaves. Only upon cell disruption, they are formed from the precursor molecules ligstroside and oleuropein by endogenous β-glucosidases and esterases. This mechanism is part of the plant defense against herbivores and pathogens by generating highly reactive intermediates and reaction products of dialdehydic structure that feature protein-crosslinking and denaturing activities. Despite an increasing interest in the research of these supposedly pharmaceutically active secondary metabolites, little is known about the endogenous enzymes involved in their production. In addition to the already described oleuropein specific β-glucosidase, OeGLU, three esterases, OeEst030, OeEst228 and OeEst679, from Olea europaea acting on deglycosylated oleosides have been identified and characterized. Accordingly, for the first time the enzymatic biotransformation of ligstroside and oleuropein to oleocanthal and oleacein, respectively, was proven using an enzyme mixture. Moreover, two further esterases from O. europeae, OeEst391 and OeEst905, were identified which showed no activity against oleosides and their aglycones, but accepted methylated phytohormones as substrates. For all tested olive enzymes esterase activity against the plant hormones methyl jasmonate (MeJA) and methyl indoleacetic acid (MeIAA) was shown. Those results indicate a possible regulatory role of the enzymes in plant hormone signaling and their descent from respective esterases. Moreover, all tested olive esterases were also capable of catalyzing transesterification in the presence of ethanol yielding ethyl jasmonate (EtJA) and ethyl indole-3-acetate (EtIAA), a feature previously not known for plant esterases. The physiological relevance of this activity, however, has not been clarified. Further investigations focused on the protein structures of OeEst030 and OeEst228. Thus, homology modeling studies suggested that the three-dimensional structures of both proteins show a high similarity to the crystal structure of PNAE and, therefore, supported an assignment to the α/β hydrolase superfamily. Accordingly, it can be assumed that in addition to a core domain consisting of five α helices and six β sheets, there is also a so-called cap domain which regulates the access of substrate to the active site. Furthermore, two of the three supposedly catalytic amino acids, namely serine and histidine, could be localized. The position of the acidic member of the catalytic triad, in contrast, could not be determined. Initially assumed amino acids could be excluded by appropriate mutagenesis studies. In summary, three novel esterases could be identified and characterized, expanding our knowledge of oleoside turnover in damaged tissue of O. europaea.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Angestoßen durch die Ergebnisse der epidemiologischen Langzeituntersuchung der „Sieben Länder Studie“, ist Olivenöl als gesundheitsförderndes Nahrungsmittel immer mehr in den Fokus pharmakologischer Forschung gerückt. Ein besonderes Interesse galt hierbei den sogenannten Olivenpolyphenolen, darunter die Secoiridoid-Derivate Oleocanthal und Oleacein, deren regelmäßige Einnahme unter anderem mit einer protektiven Wirkung gegenüber Krebs sowie kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Beide Substanzen konnten in vergleichsweise hohen Konzentrationen in nativem Olivenöl detektiert werden, während sie in intakten Früchten oder auch Blättern in der Regel nicht nachweisbar sind. Erst während dem Aufschluss der Zellen werden sie durch endogene β-Glukosidasen und Esterasen aus den Vorläufermolekülen Ligstrosid und Oleuropein gebildet. In der Natur dient dieser Mechanismus der Verteidigung der Olivenpflanze vor Fraßfeinden und Pathogenen, da entsprechende Intermediate und Reaktionsprodukte als reaktive Dialdehyde quervernetzende und denaturierende Aktivitäten gegenüber Proteinen aufweisen. Trotz eines steigenden Interesses an der Erforschung dieser vermeintlich pharmazeutisch aktiven Sekundärstoffe ist bisher allerdings wenig über die endogenen Enzyme bekannt, welche an deren Bildung beteiligt sind. Zusätzlich zu der bereits beschriebenen Oleuropein-spezifischen β-Glukosidase, OeGLU, konnten nun drei Esterasen, OeEst030, OeEst228 und OeEst679, aus Olea europaea identifiziert und charakterisiert werden, welche deglykosylierte Oleoside als Substrat akzeptieren. Damit konnte erstmals die enzymatische Biotransformation von Ligstrosid zu Oleocanthal und Oleuropein zu Oleacein mittels eines Enzymgemisches erreicht werden. Ferner konnten zwei weitere Esterasen, OeEst391 und OeEst905, aus O. europaea identifiziert werden, welche zwar keine Aktivität gegenüber Oleoside und deren Aglykone zeigten, jedoch methylierte Phytohormone als Substrat akzeptieren. So konnte für alle getesteten Oliven-Enzyme Esterase-Aktivität gegenüber den Pflanzenhormonen Methyljasmonat (MeJA) und Methylindolessigsäure (MeIAA) gezeigt werden. Dies lässt auf eine mögliche regulatorische Rolle der Esterasen in der Pflanzenhormon-Signalkaskade und auf eine evolutionäre Beziehung zu Phytohormon-Esterasen schließen. Weiterhin konnte für alle getesteten Oliven-Esterasen Transesterifizierungsaktivität nachgewiesen werden, wodurch in Anwesenheit Ethanol Ethyljasmonat (EtJA) und Ethylindolessigsäure (EtIAA) gebildet wurden. Hierbei handelt es sich um eine bisher noch nicht für pflanzliche Esterasen beschriebene Eigenschaft, deren physiologische Bedeutung nicht geklärt ist. Der letzte Abschnitt der Studie widmete sich der Aufklärung der Proteinstrukturen von OeEst030 und OeEst228. So konnten Homologie-Modellierungs-Studien nahelegen, dass die dreidimensionalen Strukturen beider Proteine eine sehr hohe Ähnlichkeit zur Kristallstruktur von PNAE aufweisen und ermöglichten somit eine Zuordnung zur α/β Hydrolase Superfamilie. Entsprechend kann davon ausgegangen werde, dass neben einer Kerndomäne, bestehend aus fünf α-Helices und sechs β-Faltblättern ebenfalls eine sogenannte „Cap“-Domäne vorhanden ist, welche den Zugang von Substrat zur Bindetasche reguliert. Ferner konnten zwei der drei vermeintlich katalytischen Aminosäuren, nämlich Serin und Histidin, lokalisiert werden. Die Position der sauren Aminosäure der katalytischen Triade konnte trotz umfangreicher Mutagenesestudien hingegen nicht abschließend bestimmt werden. Insgesamt konnten drei neue Esterasen identifiziert und charakterisiert werden, welche unser Wissen über den Umsatz von Oleosiden in beschädigten Gewebe von O. europaea erweitert.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering
Date Deposited: 19 Feb 2019 11:15
Last Modified: 19 Feb 2019 11:15
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-84153
Referees: Warzecha, Prof. Dr. Heribert and Gerhard, Prof. Dr. Thiel
Refereed: 11 January 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8415
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