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Analyse von zwei strukturell ähnlichen aber funktionell unterschiedlichen viralen K+-Kanälen: Strukturelle Ursache der inhärenten Einwärtsgleichrichtung

Eckert, Denise :
Analyse von zwei strukturell ähnlichen aber funktionell unterschiedlichen viralen K+-Kanälen: Strukturelle Ursache der inhärenten Einwärtsgleichrichtung.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2019)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyse von zwei strukturell ähnlichen aber funktionell unterschiedlichen viralen K+-Kanälen: Strukturelle Ursache der inhärenten Einwärtsgleichrichtung
Language: German
Abstract:

Viren besitzen kodierende Sequenzen für Kaliumkanäle (K+-Kanäle), welche die gleichen strukturellen und funktionellen Merkmale wie komplexere K+-Kanäle aus Pro- und Eukaryonten aufweisen. So wie Letztere verfügen sie ebenfalls über Transmembran-Helices (TMs), eine kanonische Porenregion (Poren-Loop), welche zwei TMs miteinander verbindet und die typische Signatursequenz beinhaltet. In einigen Fällen sind auch sehr kurze zytoplasmatische C- und N-Termini vorhanden. Die bisher bekannten viralen K+-Kanäle sind alle aus zwei TMs, welche über die Porenregion verbunden sind, aufgebaut. Anders als die baugleichen Kir-Kanäle zeichnen sich die viralen Kanäle jedoch über eine sehr geringe Größe aus. In Abwesenheit von großen zytosolischen Domänen sind sie in der Lage mit weniger als 100 Aminosäuren funktionelle Kanäle zu bilden. Wegen der Kombination aus robuster Kanalfunktion und geringer Größe eignen sie sich hervorragend als Modellsystem, um grundlegende Struktur- und Funktionsanalysen durchzuführen, welche auf komplexere K+-Kanäle übertragen werden können. In dieser Arbeit wurden die Kmpv-Kanäle (K+-Kanal Micromonas pusilla virus), welche zu der Familie der Phycodnaviren gehören, untersucht. KmpvSP1, welcher aus dem Micromonas pusilla virus SP1 isoliert wurde, zeigt nach Expression in HEK293-Zellen sowohl in der whole-cell Konfiguration, als auch nach Rekonstitution in einen planaren Lipid-Bilayer eine Einwärtsgleichrichtung. Diese Gleichrichtung ist nicht, wie bei Kir-Kanälen, auf einen intrazellulären Block zurückzuführen. KmpvSP1 leitet auch in einer reinen K+-Lösung fast ausschließlich Einwärtsstrom, woraus zu schließen ist, dass die Gleichrichtung eine intrinsische Eigenschaft des Kanalproteins ist. Obwohl die molekularen Mechanismen der Gleichrichtung unterschiedlich sind, zeigt KmpvSP1 dennoch einige charakteristische Funktionseigenschaften von Kir-Kanälen. Wie bei den letztgenannten Kanälen verschiebt sich nach einer Veränderung der externen K+-Konzentration die Gleichrichtung mit dem Umkehrpotential. Auch im Falle des viralen Kanals hängt dabei die Leitfähigkeit von der Quadratwurzel der externen K+-Konzentration ab. Ein zweiter viraler Kanal aus dieser Familie, Kmpv1 (K+-Kanal Micromonas pusilla virus 1), welcher eine sehr ähnliche Aminosäure-Sequenz zu KmpvSP1 aufweist, zeigt ein völlig anderes elektrophysiologisches Verhalten. Dieser Kanal hat keine Gleichrichtereigenschaften, sondern zeigt eine ohmsche K+-Leitfähigkeit. Kmpv1 weist ferner eine niedrigere Sensitivität für die typischen K+-Kanalblockern Ba2+ und Cs+ auf und besitzt eine deutlich höhere Leitfähigkeit für Rb+ als K+. Im Vergleich dazu ist der Einwärtsgleichrichter KmpvSP1 sehr sensitiv für Ba2+ und Cs+ und leitet deutlich weniger Rb+ als K+. Aufgrund der elektrophysiologischen Unterschiede wurden die beiden viralen K+-Kanäle als Werkzeug benutzt, um die Struktur-Funktionsbeziehung, die für die unterschiedlichen Funktionseigenschaften verantwortlich sind, zu analysieren. Durch kombinierte Mutations- und Funktionsanalysen kann die unterschiedliche K+- und Rb+-Leitfähigkeit und die unterschiedliche Sensitivität für Cs+ auf die TMs zurückgeführt werden. Diese geht auf den Befund zurück, dass eine Chimäre, welche die TMs aus KmpvSP1 und die Pore aus Kmpv1 vereint, eine niedrige Rb+-Leitfähigkeit, eine hohe Sensitivität für Cs+ und eine deutliche Einwärtsgleichrichtung für K+ zeigt. Das entspricht den funktionellen Eigenschaften von KmpvSP1, also dem Teil des Kanals, der die TMs zu der Chimäre beisteuert. Für die hohe Ba2+-Sensitivität in KmpvSP1 kann hingegen die Struktur der Pore und zwar die Aminosäure Serin (53) hinter dem GYG-Motiv verantwortlich gemacht werden. Durch die Substitution dieser einen Aminosäure durch Phenylalanin, welche Kmpv1 an vergleichbarer Stelle trägt, kann die Sensitivität der Mutante auf das Niveau der Sensitivität des Wildtyp-Kanals Kmpv1 gesenkt werden. Der Mechanismus der Einwärtsgleichrichtung von KmpvSP1 kann in dieser Arbeit nicht vollständig geklärt werden. Die Experimente schließen jedoch die Pore als primäre Struktur für die Gleichrichtung aus. Ein Austausch der Pore in KmpvSP1, durch die entsprechende Domäne des Kanals mit ohmscher Leitfähigkeit, führt nicht zum Verlust der Gleichrichtung. In weiteren Untersuchungen wurden diejenigen Aminosäuren, in denen sich der KmpvSP1 Kanal von Kmpv1 unterscheidet, so mutiert, dass sie dem Kmpv1 gleichen. Aus der Analyse von 22 funktionellen Punktmutanten ergab sich nur eine Mutante, KmpvSP1 F72I, bei der die makroskopischen Ströme zwar sehr klein, aber nicht mehr einwärtsgleichrichtend waren. Nach einer funktionellen Rekonstitution der Mutante in planaren Lipid-Bilayern zeigte der Kanal, anders als der Wildtyp-Kanal, Kanalfluktuationen im positiven Spannungsbereich. Auch wenn diese Mutation das Schaltverhalten des Kanals verändert, kann die Aminosäure F72 nicht als einzige Ursache für die Gleichrichtung interpretiert werden. Auch die F72I Mutante zeigt immer noch eine Einwärtsgleichrichtung mit einer höheren Offenwahrscheinlichkeit bei negativen im Vergleich zu positiven Spannungen. Zudem hat die gleiche Mutation in einem nahe verwandten K+-Kanal von KmpvSP1 dem KmpvPL1, keinerlei Auswirkung auf die Gleichrichtereigenschaften.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Viruses have coding sequences for potassium channels (K+ channels), which have the same structural and functional characteristics of more complex K+ channels from pro- and eukaryotes. Like the latter, they also have transmembrane domains (TMs), a canonical pore region that connects two TMs and the typical signature sequence; in some cases, very short cytoplasmic C- and N-termini are also present. The viral K+ channels known so far are all composed of two TMs, which are connected via the pore region. Unlike Kir channels, which exhibit the same architecture, the viral channels have a very small size. In the absence of large cytosolic domains, they are able to form functional channels with less than 100 amino acids. This combination of robust channel function and small size make them ideal model systems for basic structural and functional analyses that can be transferred to more complex K+ channels. In this work the Kmpv channels (K+ channel Micromonas pusilla virus), which belong to the family of Phycodnaviruses, were investigated. KmpvSP1, isolated from Micromonas pusilla virus SP1, shows an inward rectification. This occurs in whole-cell recordings after expression of the channel in HEK293 cells and after reconstitution of the channel protein in a planar lipid bilayers. This rectification is not, as with Kir channels, due to an intracellular block. KmpvSP1 also conducts almost exclusively an inward current in a pure K+ solution. This underscores that the rectification is an intrinsic property of the channel protein. Although the molecular mechanisms of rectification are different, KmpvSP1 nevertheless shows some characteristic functional properties of Kir channels. As with the latter channels a change in the external K+ concentration causes a shift of the rectification with the reversal potential. Like in Kir channels, the conductivity of the viral channel also depends on the square root of the external K+ concentration. A second viral channel, Kmpv1 (K+ channel Micromonas pusilla virus 1), which has a very similar amino acid sequence to KmpvSP1, shows a different electrophysiological behavior. This channel has no rectifier properties but exhibits an ohmic K+ conductivity. Kmpv1 also has a lower sensitivity to the typical K+ channel blockers Ba2+ and Cs+ and a significantly higher conductivity for Rb+ compared to K+. The inward rectifier KmpvSP1 in contrast is very sensitive to Ba2+ and Cs+ and conducts significantly less Rb+ than K+. Because of the electrophysiological differences, the two viral K+ channels were used as a tool to analyze the structure/function correlates responsible for the different functional properties. A combination of mutational and functional studies showed that the different K+ and Rb+ conductivity and the different sensitivity to Cs+ are related to the structure of the TMs. This is supported by the finding that a chimaera combining the TMs of KmpvSP1 and the pore of Kmpv1 shows a low Rb+ conductivity, a high sensitivity to Cs+ and a clear inward rectification for K+. This corresponds to the functional properties of KmpvSP1, the part of the channel that contributes the TMs in the chimera. The high Ba2+ sensitivity in KmpvSP1 in contrast can be attributed to the structure of the pore, namely the amino acid serine (53) behind the GYG motif. By substituting this one amino acid with phenylalanine, e.g. the amino acid present at this position in Kmpv1, the sensitivity of the mutant can be reduced to the level of the wild-type channel Kmpv1. The mechanism of inward rectification of KmpvSP1 cannot be fully clarified in this work. However, the experiments exclude the pore as the primary structure responsible for the rectification. Replacing the pore in KmpvSP1 by the corresponding domain of the channel with ohmic conductivity does not lead to loss of rectification. In further investigations, the amino acids in which the KmpvSP1 channel differs from Kmpv1 were mutated to resemble Kmpv1. The analysis of 22 functional point mutants resulted in only one mutant, F72I, in which the macroscopic currents were very small, but no longer inwardly rectifying. After functional reconstitution of the mutant in planar lipid bilayers, the channel showed channel fluctuations in the positive voltage range, unlike the wild type channel. Even though this mutation apparently changes the gating of the channel, the amino acid F72 cannot be interpreted as the cause for the rectification. Also, the F72I mutant still shows an inward rectification with a higher open probability at negative compared to positive stresses. Furthermore, the same mutation in a close relative of KmpvSP1 the KmpvPL1 channel, has no effect on the rectifier properties.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 04 Feb 2019 13:29
Last Modified: 04 Feb 2019 13:29
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-83209
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 12 December 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8320
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