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Multivalent display of functional biomacromolecules: a modular approach

Valldorf, Bernhard (2016)
Multivalent display of functional biomacromolecules: a modular approach.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Multivalent display of functional biomacromolecules: a modular approach
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Date: 2016
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 29 July 2016

In Biochemistry, the term “multivalency” defines a concept of simultaneous, multiple recognition/binding events between two (macro)molecular counterparts. Enabling enhanced binding strength even in the case of intrinsically moderate-potent ligands, this concept has found rather wide application in biomolecular engineering and drug design. In the present work, focused on the development of multivalent modulators of biological and biotechnological processes, oligomerization of functional biomolecules was achieved by their genetic fusion or enzyme-mediated ligation to oligomerization domains, as well as by non-covalent coiled-coil interactions of modified proteins with multivalent bioparticles. Summarized in three peer-reviewed publications given in the cumulative part, the results of this doctoral research contribute to the toolbox of synthetic and biotechnological methods for the generation of multivalent architectures with tailor-made properties. Conceptually, the study can be separated into two independent research branches, the first one exploring effects of avidity by scaffold-based oligomerization of therapeutically relevant target-binding molecules, and the second one dealing with immobilization of orthogonal biocatalytic cascades on bioparticles. In our previous investigation it was shown that engineered cystine-knot miniproteins based on the scaffold of trypsin inhibitor McoTI-II from the squash plant Momordica cochinchinensis are able to bind a therapeutically relevant target, namely cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), however, with low affinity. The potency of these binders can be improved either applying rather sophisticated and time-consuming affinity maturation, or by inducing avidity effects upon multimerization. The latter approach was considered in the present work due to the fact that dimeric CTLA 4 protein is presented on the cell surface in high copy numbers. Within the frame of this work, binding molecules of peptidic nature, among them particular oligopeptides and cystine-knot miniproteins, were attached to oligovalent scaffold proteins by genetic fusion yielding stable oligomers upon recombinant expression. As expected, oligomerization of low-affinity CTLA-4 binder cystine knot MC-CT-010 (Kd = 3.7 µM) on the Fc part of human IgG and the C-terminal oligomerization domain of human C4b binding protein (C4BP) lead to a significant improvement of its functional binding affinity. Indeed, a more than 400-fold improved Kd of 8 nM was determined for the heptavalent fusion construct comprising the C4BP scaffold and MC-CT-010 binder. In order to extend the repertoire of oligomerization methods and to ensure tailoring of multivalent architectures in a modular way, enzyme-catalyzed conjugation of functional molecules with the desired oligovalent scaffolds was applied. To this end, the Fc and C4BP scaffolds were N- or/and C-terminally functionalized with peptidic recognition tags enabling subsequent sortase A-catalyzed ligation with the ligands of interest bearing a respective counterpart. This Lego®-like strategy allowed for the fast enzyme-promoted conjugation of functional monomers at the desired positions within the scaffold. Being applied to death receptor 5 (DR5) targeting peptides (DR5TPs) and the modified Fc and C4BP scaffolds, this approach yielded dimeric, tetrameric and heptameric constructs possessing improved binding capacity towards DR5. These results are of special value as DR5 is overexpressed on cancer cells and, being crosslinked, induces an apoptotic signaling cascade. Interestingly, the strongest binding to DR5 in vitro was observed when the DR5TP ligand was attached to the carboxytermini of C4BP in a linear fashion. Furthermore, this engineered heptad revealed a remarkable biological activity, being able to specifically induce apoptosis in living COLO205 cancer cells (EC50 = 3 nM). We ascertained that ligand number per scaffold molecule as well as their position and spatial orientation is crucial for the biological activity of DR5-targeting oligomers. In general, the established platform allowed for the fast oligomerization of functional probes with further investigation of the steric factors, as well as issues of ligand density, which can influence binding and bioactivity. In addition to covalently bound oligomeric constructs, a non-covalent coiled-coil interaction was used to fabricate enzyme-loaded bioparticles able to promote orthogonal biocatalytic cascades. The carrier particles were derived from a recombinant polyhydroxyalkanoate synthase (PhaC) fusion protein, displaying a multitude of negatively charged Ecoil helices on their surface. Immobilization of enantioselective NADH-dependent alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis and a formate dehydrogenase from Candida boidinii was achieved through the interaction of their engineered Kcoil domains with the respective Ecoil counterpart on the surface of PhaC particles. The resulting multimeric, multifunctional system enabled a catalytic cascade for the stereoselective production of chiral alcohols from ketones – an important step in the manufacturing of pharmaceuticals and fine chemicals. In the frame of our study, the presence of immobilized proteins on PhaC particles was revealed by atomic force microscopy imaging, and the resulting system appeared fully functional. Thus, complete conversion of p-chloroacetophenone to (S)-4-chloro-α-methylbenzyl alcohol by ADH with parallel cofactor regeneration by FDH was confirmed by GC-MS analysis of the reaction products. Moreover, the enantioselectivity of ADH was not affected by the immobilization onto the particles, as was confirmed by GC-MS analysis applying the chiral stationary phase (ee > 99 %). Interestingly, application of an aqueous biphasic system allowed us to use highly concentrated solutions of hydrophobic substrates in organic solvents. In addition, this multienzyme construct could be easily tailored depending on the functional task as the active components could be presented on bioparticles in different ratios, and their orientation can be controlled by the position of the coiled-coil components.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In der Biochemie definiert der Term „Multivalenz“ ein Konzept von gleichzeitigen und mehrfachen Erkennung-/Bindungsereignissen zwischen zwei (makro-)molekularen Gegenstücken. Da es sogar bei moderat potenten Liganden eine verbesserte Bindungsstärke ermöglicht, hat dieses Konzept weite Anwendung in der biomolekularen Entwicklung und dem Wirkstoffdesign gefunden. In der vorliegenden Arbeit, deren Fokus auf der Entwicklung multivalenter Modulatoren von biologischen und biotechnologischen Prozessen lag, wurde die Oligomerisierung funktioneller Moleküle durch die genetische Fusion oder enzymatische Kopplung mit Oligomerisierungsdomänen sowie durch eine nicht-kovalente coiled-coil Interaktion modifizierter Proteine mit multivalenten Biopartikeln erreicht. Die in den drei begutachteten Publikationen des kumulativen Teils zusammengefassten Ergebnisse dieser Doktorarbeit liefern einen Beitrag zu den synthetischen und biotechnologischen Werkzeugen und Methoden zur Generierung von multivalenten Architekturen mit maßgeschneiderten Eigenschaften. Diese Studie kann konzeptionell in zwei unabhängige Forschungszweige unterteilt werden. Der Erste behandelt die Erforschung von Aviditäts-Effekten durch die Gerüstmolekül-basierte Oligomerisierung von therapeutisch relevanten Zielmolekül-bindenden Molekülen. Im zweiten Teil steht die Immobilisierung orthogonaler, biokatalytischer Kaskaden auf Biopartikeln im Mittelpunkt. In einer vorangegangen Forschungsarbeit wurde gezeigt, dass modifizierte Cystinknoten-Miniproteine, basierend auf dem Trypsin-Inhibitor McoTI-II aus der Kürbispflanze Momordica cochinchinensis, in der Lage sind, ein therapeutisch relevantes Zielmolekül, das cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), zu binden, jedoch mit geringer Affinität. Die Potenz dieser Binder kann entweder über aufwändige und langwierige Affinitätsmaturierung oder durch die Nutzung von Aviditätseffekten mittels Multimersierung verbessert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindemoleküle peptidischer Natur, unter diesen spezielle Oligopeptide und Cystinknoten-Miniproteine, durch genetische Fusion an oligovalente Gerüstproteine angebracht. Die Oligomerisierung des niedrig affinen CTLA-4 Binders, Cystin-Knoten MC-CT-010 (Kd = 3,7 µM), mit dem Fc-Teil des humanen IgG und der C-terminalen Oligomerisierungsdomäne des humanen C4b-Bindeproteins (C4BP) führte zu einer signifikanten Verbesserung der funktionellen Bindeaffinität. Insbesondere wurde für das heptavalente Fusionskonstrukt, bestehend aus dem C4BP Gerüstmolekül und dem Binder MC-CT-010, eine mehr als 400-fach verbesserte Kd von 8 nM erreicht. Um das Repertoire an Oligomeriserungsmethoden zu erweitern und eine modulare Anpassung multivalenter Architekturen zu ermöglichen, wurden funktionelle Moleküle mit den gewünschten oligovalenten Gerüstmolekülen durch eine Enzym-katalysierte Konjugation verknüpft. Hierzu wurde das Fc- und C4BP-Gerüstmolekül N- und/oder C-terminal mit peptidischen Erkennungssequenzen funktionalisiert, um eine anschließende Sortase A-katalysierte Ligation mit den Liganden von Interesse zu ermöglichen, welche das passende Gegenstück tragen. Diese Lego®-artige Strategie erlaubt eine schnelle Enzym-vermittelte Konjugation von funktionalen Monomeren an gewünschte Positionen am jeweiligen Gerüstmolekül. Durch die Anwendung dieser Strategie auf Todesrezeptor 5 (DR5) targetierende Peptide (DR5TPs) und die modifizierten Fc- und C4BP-Strukturgerüste, konnten dimere, tetramere und heptamere Konstrukte mit verbesserter Bindeeigenschaft gegenüber DR5 erzeugt werden. Diese Ergebnisse sind besonders im Bezug auf DR5 von Relevanz, da dieser auf Tumorzellen überexpremiert wird und durch seine Quervernetzung eine apoptotische Signalkaskade ausgelöst wird, die zum Zelltod führt. Interessanterweise wurde die stärkste Bindung an DR5 in vitro beobachtet, wenn DR5TP Liganden linear mit den Carboxytermini von C4BP verknüpft wurden. Des Weiteren zeigte das funktionalisierte Heptamer eine bemerkenswerte biologische Aktivität. Es induzierte Apoptose in lebenden COLO205 Tumorzellen bei einer effektiven Konzentration (EC50) von 3 nM. Wir konnten feststellen, dass die Ligandenzahl pro Gerüstmolekül sowie die räumliche Orientierung wesentlich für die biologische Aktivität von DR5-targetierenden Oligomeren sind. Im Allgemeinen ermöglicht die neu etablierte Plattform die schnelle Oligomerisierung funktioneller Proben und erleichtert eine Untersuchung des Einflusses von sterischen Faktoren und der Ligandendichte auf die Bindekapazität und Bioaktivität. Zusätzlich zu kovalent verknüpften oligomeren Konstrukten wurde eine nicht-kovalente Interaktion verwendet, um Enzym-beladene Biopartikel herzustellen und damit Biokatalysatoren für Kaskadenreaktionen in hoher Dichte und enger räumlicher Nachbarschaft auf einer Gerüstoberfläche zu platzieren. Die Trägerpartikel wurden von einem rekombinanten Polyhydroxyalkanoatsynthase (PhaC)-Fusionsprotein abgeleitet und präsentieren eine Vielzahl an negativ geladenen Ecoil-Helices auf ihrer Oberfläche. Die Immobilisierung einer enantioselektiven NADH-abhängigen Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis und einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii wurde durch die Interaktion ihrer aminoterminal angefügten Kcoil-Domänen mit dem entsprechenden Ecoil-Gegenstück auf der Oberfläche von PhaC-Partikeln erreicht. Das resultierende multimere und multifunktionelle System ermöglicht eine katalytische Kaskade für die stereoselektive Produktion von chiralen Alkoholen aus Ketonen – ein wichtiger Schritt in der Herstellung von Pharmazeutika und Feinchemikalien. Im Rahmen dieser Studie wurde die Präsenz von immobilisierten Proteinen auf den PhaC-Partikeln durch Rasterkraftmikroskopie ermittelt. Die Kaskadenreaktion auf der Partikeloberfläche wurde ebenfalls analysiert. So wurde ein vollständiger Umsatz von p-Chloroacetophenon zu (S)-4-Chloro-α-methylbenzylalkohol durch ADH bei paralleler Regenerierung des Kofaktors durch FDH mittels GC-MS Analyse der Reaktionsprodukte nachgewiesen. Des Weiteren wurde die Enantioselektivität der ADH durch die Immobilisierung auf den Partikeln nicht beeinträchtigt, wie GC-MS Analysen mit einer chiralen stationären Phase zeigten (ee > 99 %). Interessanterweise erlaubte die Verwendung eines wässrig-biphasischen Systems die Verwendung von konzentrierten Lösungen des hydrophoben Substrates in organischen Lösemitteln. Zusätzlich kann das Multienzymkonstrukt einfach an den jeweiligen funktionellen Prozess angepasst werden, da die aktiven Komponenten in verschiedenen Verhältnissen präsentiert werden können und ihre Orientierung durch die Positionierung der coiled-coil Komponente gesteuert werden kann.

Uncontrolled Keywords: Scaffolding, Death Receptor 5, C4BP, Apoptosis, Avidity, Multivalency
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-57558
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 21 Nov 2016 09:16
Last Modified: 09 Jul 2020 01:27
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5755
PPN: 395987482
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