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Analysis of the IgE epitope profile of the soybean allergen Gly m 4

Husslik, Felix (2016):
Analysis of the IgE epitope profile of the soybean allergen Gly m 4.
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
[Ph.D. Thesis]

Analysis of the IgE epitope profile of the soybean allergen Gly m 4_Dissertation_FelixHusslik_2016.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analysis of the IgE epitope profile of the soybean allergen Gly m 4
Language: English

Individuals with birch pollinosis may show allergic reactions after consumption of soybean-containing food. This is caused by cross-reaction of IgE directed against the major birch pollen allergen Bet v 1 with the structurally homologous allergen Gly m 4 from soybean. Hypersensitivity reactions in birch-soy allergy range from mild reactions to severe systemic reactions. Sera of birch pollen-allergic subjects may contain IgE to Gly m 4, even though no allergy to soy is present. Thus Gly m 4-specific IgE per se is not a suitable biomarker for birch-related soy allergy. To develop novel approaches for improved diagnosis and therapy of birch-soy allergy, knowledge on epitopes and IgE epitope profile of Gly m 4 for is needed. To date, data on epitopes of Bet v 1 and its homologous allergen Gly m 4 is very limited. In this study, birch pollen-allergic patients with (27 subjects) and without (20 subjects) clinically confirmed allergy to soybean were included and analyzed regarding Gly m 4-specific serum IgE/IgG levels and epitope profiles of Gly m 4 for IgE. Specific IgE levels against Bet v 1, Gly m 4 and further soy allergens Gly m 5 and Gly m 6 were determined by ImmunoCAP™ and IgE binding to rGly m 4 and soy extract was tested in western blot. To analyze putative IgE epitopes of Gly m 4, non-allergenic Norcoclaurine synthase (NCS) from meadow rue was used as a model protein. NCS is structurally homologous to Gly m 4 but exhibits none to very little binding of Gly m 4-specific IgE antibodies enabling grafting of Gly m 4 epitopes onto the model protein. Potential candidate residues of Gly m 4 were selected by bioinformatic analysis of antibody-binding phage-displayed peptides and mapping of segments of Gly m 4 primary structure onto the molecular surface of the allergen. As a result a library of recombinant NCS variants with potential IgE binding was generated. In addition, five multiple substitutional variants of rGly m 4 with a total number of 18 amino acid substitutions crucial for IgE binding were generated and analyzed for antibody binding with patients’ sera. Furthermore a misfolded variant of each rBet v 1a and rGly m 4 was generated and defined molar ratios of folded/misfolded variants were compared in different immunological and physicochemical assays. Gly m 4-specific median IgE and IgG levels of allergic (IgE: 9.3 kUA/L, IgG: 8.1 mgA/L) and non-allergic (IgE: 4.5 kUA/L, IgG: 8.3 mgA/L) subjects were comparable. The specific IgE levels did not correlate to the (severity of) clinical phenotypes. 51 candidate residues of Gly m 4 were selected for IgE epitope analysis and 46 potential functional IgE epitopes, single residues within a structural IgE epitope which dominate the energetics of allergen-IgE binding, were identified with IgE binding to ΔNCSN42/P49 variants. The putative functional IgE epitope pattern was individual for each patient and not distinguishable between allergic and non-allergic subjects. Using five rGly m 4 variants parts of the results of the NCS-based analyses could be confirmed with 18 potential functional IgE epitopes identified. 46 potential functional IgE epitopes clustered into six distinct putative IgE-binding areas on Gly m 4 and eleven NCS variants (ΔNCSN42/P49_1-11) presenting parts of these epitope areas were purified, showing a Gly m 4-type secondary structure according to CD measurements. Densitometric analysis for binding of IgE antibodies was performed via dot blot with sera of the study population but no characteristic IgE epitope pattern could be found. In contrast ΔNCSN42/P49_9 was identified as most suitable marker to distinguish soy allergic from tolerant patients in birch-related soybean allergy with a sensitivity and specificity of 68% and 93%, respectively. Using a pool of ΔNCSN42/P49 variants a depletion of Gly m 4-specific IgE binding to about 80% and 70% in pooled sera of patients with and without soybean allergy, respectively, was possible. Therefore identified putative functional IgE epitopes are specific for interaction with IgE antibodies in study population. With ΔNCSN42/P49_9 a differentiation between sensitization to Gly m 4 and clinically confirmed soybean allergy might be possible. The usage of a Gly m 4-specific epitope library might be a more promising tool for evaluating birch-related soybean allergy compared to ImmunoCAP™ and screening of substitutional Gly m 4 variants alone. However no correlations between patient’s IgE epitope profile and specific symptoms to soy or severity of allergic reactions could be found using NCS-based epitope library. Rather patient-specific epitope pattern might be relevant for birch-related soybean allergy. Therefore a thorough diagnosis by the combination of component-resolved diagnosis and profound epitope analysis might be mandatory in the future. Using two misfolded variants of rBet v 1a and rGly m 4 the impact of unstructured allergens in rBet v 1a/rGly m 4 preparations was addressed with physico- and immunological assays. Both rBet v 1aS112P/R145P and rGly m 4S111P/L150P showed a highly disordered protein conformation and reduced IgE binding frequencies with analyzed patients’ sera. With CD spectroscopy, immunoblot, ELISA and RBL cell release assay defined combinations of native and unstructured allergen were assessed concerning secondary structure and IgE binding. Correlation of rBet v 1a content with secondary structure and IgE binding was suitable only at high rBet v 1aS112P/R145P levels in mixtures. CD spectroscopy and ELISA performed more precise compared to immunoblot and rat basophil cell mediator release assay where larger deviations between native and unstructured allergen were necessary. In addition, quantification of IgE-binding allergen was difficult for concentrations of rBet v 1a ≤10% in all assays. Overall, CD, ELISA and RBL cell release assay underestimated while immunoblot overestimated the actual level of rBet v 1a. Results of both misfolded variants rBet v 1aS112P/R145P and rGly m 4S111P/L150P might be used within screening of hypoallergenic molecules with potential use in treatment of allergies or in quality assessment of recombinant allergen preparations.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Patienten mit einer Birkenpollenallergie zeigen oftmals auch allergische Reaktionen auf sojahaltige Nahrungsmittel oder Getränke. Grund ist eine Kreuzreaktion von IgE-Antikörpern gerichtet gegen das Hauptallergen der Birke, Bet v 1, und dem strukturhomologen Allergen Gly m 4 der Sojabohne. Die klinischen Symptome können in der Birkenpollen-assoziierten Sojaallergie bis hin zu schweren Reaktionen, wie einem anaphylaktischen Schock, reichen. Patienten mit einer Birkenpollen-assoziierten Sojaallergie weisen demnach sowohl IgE-Antikörper gegen Bet v 1 als auch Gly m 4 auf. Auffällig ist hierbei, dass Birkenpollenallergiker ohne assoziierte Sojaallergie oft auch diese beiden Allergen-spezifischen IgEs besitzen. Deshalb kann die Präsenz von Gly m 4-gerichteten IgEs an sich nicht als geeigneter Marker für eine Sojaallergie eingesetzt werden. Um eine exakte Diagnose und wirkungsvolle Therapie zur Behandlung solcher Allergien zu ermöglichen, sind neben Patientendaten auch detaillierte Informationen über die IgE-bindenden Bereiche, die sogenannte Epitope, auf Gly m 4 nötig. Bis heute ist jedoch nur wenig über IgE-Epitope von Bet v 1 und seinem Homolog Gly m 4 bekannt. In diese Arbeit wurden 27 bzw. 20 Birkenpollenallergiker mit bzw. ohne eine klinisch bestätigte Sojaallergie eingeschlossen und hinsichtlich ihrer Gly m 4-spezifischen IgE- und IgG-Konzentrationen im Serum, sowie IgE-Epitopprofile untersucht. Bet v 1 , Gly m 4-, Gly m 5- und Gly m 6-gerichtete IgE-Level wurden mittels ImmunoCAP™ gemessen und die IgE-Bindung an rGly m 4 sowie Sojaextrakt anhand Western Blots bestimmt. Um mögliche IgE-Epitope analysieren zu können, wurde die nicht-allergene Norcoclaurinsynthase (NCS) aus der gelben Wiesenraute als Modelprotein eingesetzt. NCS ist strukturhomolog zu Gly m 4 zeigt aber nur wenig bis gar keine Bindung an Gly m 4-spezifische IgEs und kann daher für das Epitopgrafting von Gly m 4 auf NCS verwendet werden. Aminosäuren von Gly m 4, die als mögliche IgE-bindende Reste in Frage kommen, wurden mittels einer bioinformatischen Analyse von IgE-bindenden Peptiden einer Phagenbibliothek sowie durch das Mappen von Primärstrukturabschnitten von Gly m 4 auf dessen Proteinoberfläche identifiziert. So konnte eine Bibliothek von rekombinant hergestellten NCS Varianten mit potenzieller IgE-Bindung erzeugt werden. Außerdem wurden fünf Varianten von rGly m 4, die insgesamt 18 potentiell IgE-relevante Aminosäureaustausche zeigen, erzeugt und hinsichtlich ihrer Bindung an Patienten-IgE untersucht. Zusätzlich wurden zwei ungefaltete Varianten von rBet v 1a und rGly m 4 hergestellt und in unterschiedlichen Mischungen mit korrekt gefaltetem rBet v 1a/rGly m 4 anhand diverser immunologischer und physiko-chemischer Verfahren untersucht. Hinsichtlich ihrer mittleren Gly m 4-spezifischen IgE- und IgG-Konzentrationen konnte kein Unterschied zwischen Patienten mit (IgE: 9.3 kUA/L, IgG: 8.1 mgA/L) und ohne (IgE: 4.5 kUA/L, IgG: 8.3 mgA/L) Sojaallergie gefunden werden. Weiterhin korrelierten diese spezifischen IgE-Konzentrationen nicht mit dem klinischen Phänotyp der Patienten. Insgesamt konnten aus 51 Gly m 4-spezifischen Aminosäuren 46 potentiell funktionale IgE-Epitope identifiziert werden. Bei funktionalen Epitopen handelt es sich um einzelne Aminosäuren, welche innerhalb eines strukturellen IgE-Epitops die Energetik der Allergen-IgE-Bindung dominieren. Das potentielle, funktionale IgE-Epitopprofil jedes Patienten war individuell und nicht charakteristisch für die Unterscheidung zwischen Allergikern und Nicht-Allergikern. Durch die Analyse mittels der fünf Substitutionsvarianten von rGly m 4 konnten Teile der Ergebnisse der NCS-Epitopanalyse bestätigt werden. Insgesamt ergaben sich hier 18 potentielle, funktionale IgE-Epitope. Alle 46 potentiell funktionalen IgE-Epitope konnten in sechs mögliche Epitopbereiche auf Gly m 4 zusammengefasst werden. Elf NCS-Varianten (ΔNCSN42/P49_1-11), die Teile dieser Epitopbereiche aufweisen, wurden hergestellt und zeigten zu Gly m 4 vergleichbare CD-Spektren. Eine densitometrische Analyse der IgE-Bindung in Patientenseren wurde mittels eines Dot Blots durchgeführt, jedoch konnte kein charakteristisches IgE-Epitopprofil ermittelt werden. Hingegen konnte die NCS Variante ΔNCSN42/P49_9 mit einer Sensitivität bzw. Spezifität von 68% bzw. 93% als vielversprechender Marker identifiziert werden, um Sojaallergiker von toleranten Patienten zu unterscheiden. Weiterhin war mit einer Mischung aus allen ΔNCSN42/P49 Varianten eine Depletion der Gly m 4-spezifischen IgE-Bindung in den Seren der Patienten mit bzw. ohne Sojaallergie auf etwa 80% bzw. 70% möglich. Demnach sind die identifizierten potentiell funktionalen IgE-Epitope spezifisch für die Bindung von IgE-Antikörpern in der Studiengruppe. ΔNCSN42/P49_9 scheint die passendste Variante zu sein, mit der eine Unterscheidung zwischen Sensibilisierung auf Gly m 4 und klinisch bestätigter Sojaallergie möglich ist. Der Einsatz einer Gly m 4-spezifischen Epitopbibliothek kann somit eine vielversprechendere Möglichkeit zur Analyse von Birkenpollen-assoziierter Sojaallergie, verglichen zu ImmunoCAP™ oder der Untersuchung von Gly m 4-Substitutionsvarianten darstellen. Jedoch konnte auch mit der NCS-Epitopbibliothek keine Korrelation zwischen dem IgE-Epitopprofil der Patienten und ihren allergischen Symptomen sowie dem Schweregrad der Symptome ermittelt werden. Vielmehr scheint ein patientenspezifisches Epitopprofil Grundlage für eine Birkenpollen-assoziierte Sojaallergie zu sein. Somit könnte also eine Kombination aus rekombinant hergestellten Allergenen und der detaillierten Untersuchung mittels einer Epitopbibliothek zukünftig zu einer genaueren Diagnose führen. Mittels der beiden Allergenvarianten von rBet v 1a und rGly m 4 konnte der Einfluss von ungefaltetem Protein durch physikochemische und immunologische Methoden in Präparaten aus rBet v 1a bzw. rGly m 4 untersucht werden. Beide Varianten rBet v 1aS112P/R145P und rGly m 4S111P/L150P zeigten eine ungefaltete Proteinstruktur sowie eine reduzierte IgE-Bindung in den eingesetzten Patientenseren. In CD-Spektroskopie, Immunoblot, ELISA und RBL-Zellassay wurden definierte Mischungen aus nativem und ungefaltetem Allergen hinsichtlich Sekundärstruktur und IgE-Bindung untersucht. Eine Korrelation von rBet v 1a-Konzentration mit der Sekundärstruktur des Allergens sowie der IgE-Bindung war nur bei hohen Konzentrationen an rBet v 1aS112P/R145P möglich. Hier lieferten CD-Spektroskopie und ELISA präzisere Ergebnisse als der Immunoblot und RBL-Zellassay. Bei letzteren waren größere Unterschiede zwischen nativem und ungefaltetem Allergen für eine eindeutige Korrelation nötig. Weiterhin war die Bestimmung an IgE-bindendem Allergen in allen Assays für rBet v 1a-Konzentrationen ≤10% schwierig. CD-Spektroskopie, ELISA und RBL-Zellassay führten zu einer Unterschätzung des tatsächlichen Gehalts an rBet v 1a, wohingegen mit dem Immunoblot mehr rBet v 1a gemessen wurde als tatsächlich in der Probe vorhanden war. Die Ergebnisse der beiden Faltungsvarianten rBet v 1aS112P/R145P und rGly m 4S111P/L150P könnten für das Screening von hypoallergenen Molekülen zur möglichen Behandlung von Allergien oder in der Qualitätskontrolle von Allergenpräparaten eingesetzt werden.

Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 07 Department of Chemistry
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 17 Nov 2016 09:18
Last Modified: 09 Jul 2020 01:26
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-57360
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Stefan, Prof. Dr. Vieths
Date of oral examination: 25 October 2016
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5736
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